On njaaraama e njillu mon e Nature.com.Njaajeendi feerorde nde kuutorto-ɗon ndee ina famɗi ballal CSS.Ngam heɓde humpito ɓurngo moƴƴude, min mbasiyii ma huutoraade feerorde hesɗitinaande (walla momtude mbaadi jokkondire e nder Internet Explorer).E nder ɗuum, ngam tabitinde ballal jokkungal, maa min kollite lowre ndee tawa alaa styles e JavaScript.
Nandugol e kullon ladde, ina sikkaa no feewi wonde ɓowɗi ngalaa hormon steroid jibinirgol worɓe.E nder Anopheles gambiae, steroid ekdison 20-hidroksiekdison (20E) ina wayi no ƴellitii ngam haɓaade ƴellitaare egguuji so ɗi sinndaama e rewɓe so ina njibina worɓe2 e ngam saabaade jibinirgol worɓe3 ƴellitaare egguuji e jokkondire ko sifaaji jibinannde potɗi huutoreede, faamde no ɓowɗi Anopheles rewɓe ɗii kuutortoo ɗeen maale hormon ina waawi wallitde peewnugol porogaraamuuji kesi ngam haɓaade paawngal.Ɗoo, eɗen peeñnina wonde ɗeen golle jibinannde ina njuɓɓinee e sterooji ceertuɗi jibinannde rewrude e lowre kuuɓtodinnde enzymes ecdysteroid-activating-activating/in ecdysone oksidaa, 3-dehydro-20E (3D20E), reenoowo jibinannde e uddude jaɓɓugol debbo caggal nde jibinaa e jokkere enɗam e huutoraade ɗum e defosforilaasiyoŋ.Teskaama kadi, jokkere enɗam 3D20E ina addana kadi feeñninde taƴe jibinannde jogorɗe jogaade cellal eggudu Pmodium rewɓe.20E ummoriiɗo e debbo yaltintaa jaabawol jokkere enɗam, kono ina addana yimɓe jokkere enɗam waɗde egguuji caggal nde kinaaseeji 20E-inhibiting kinaaseeji ɗii ndartinaa nafoore jibinannde ɓowɗi mboros malaria.
Caɗeele malaria e maayɗeele ina ɓeydoo kadi4 sabu ŋakkeende reentaade mborosaaji e nder ɓowɗi Anopheles, ko kañum tan woni sabaabu gonɗo e mborosaaji paawngal e nder aadee.Biyoloji jokkondire ɗeen ɓowɗi ko huunde teeŋtunde no feewi wonande peeje kese ngam haɓaade malaria sabu rewɓe ina njibina tan ko laawol gootol5; waɗde ndeeɗoo hiirde wootere jokkere enɗam ina jogii mbaawka mawka ngam ustude keeweendi ɓowɗi e nder ladde.
Rewɓe ina mbaɗta waasde jogaade kattanɗe jokkondirde caggal nde keɓi hormon steroid toowɗo e worɓe.Wiɗtooji kollitii wonde sabaabu caɗeele ɓeydagol jokkondiral ko 20-hidroksiekdison (20E), hormon steroid ɓurɗo anndeede ko reenoowo mbaydi molting e nder daawal larve ina jogii Muuñal Anopheles jeyaangal e mbaydi Cellia7, ngal renndini ko e nder Afrik, ina jeyaa heen mborosaaji ɓurɗi bonde e ñawu nguu, ina jeyaa heen Anopheles gambiae.Ɗum ina teskaa sabu e nder ɗiin muuñal rewɓe ina peewna kadi 20E caggal kala ñaamde ƴiiƴam, e 20E ina riiwta laawol oogenesis re.we ko yowitii e). e nder ɗuum rewɓe ina kawra e maandeeji ummoriiɗi e ɓulli ɗiɗi ceertuɗi e ekdison (transfer masculin e induction alimentaire de sang) tawa ina ustoo mbaawka mum en e jokkere enɗam.E goonga, so tawii 20E mo rewɓe peewnata oo ina addana ɗum en ŋakkere ɓiɗɓe, ɗum addanta ko ŋakkere jibinannde e nder yimɓe ñamlooɓe rewɓe, ko ɗum huunde nde heewi wonde e ɗeen moquito5.
Facciro ina waawi wonde wonde A. gambiae worɓe ina mbayla ekdison keeriiɗo worɓe moɗtuɗo, ko ɗum huutortoo kaskaade signaling e nder reedu debbo, ɗum addana ɗum waasde jogaade jokkere enɗam.Kono noon, hay so tawii ko ƴiye ina njogii hormonuuji steroid keewɗi, ko wayi no estrogen e androgenf steroid en njiytaaka e nder ɓowɗi.
En ndarni ngam anndude repertoire hormon steroid e nder ƴiiƴam gorko (MAG) A. gambiae gonɗo e njiylawu steroid baawɗo waylude.Kuutoragol kromatogaraafi ndiyam toowɗo baawɗo huutoreede e spektorometri masse tandem (HPLC-MS/MS) wonaa feere ɓurnde famɗude keertiinde nde (ecdysviE). e nder ndeeɗoo ƴiiƴam, ina tabitina njeñtudi ɓennundi.Kono tan, eɓɓoore ndee ɓuri heewde ko e steroid fosforilaat oksidaa, jokkondirɗo e foormula 3-dehidro-20E-22-fosfaat (3D20E22P)12 (Natal 1).Fooyre woɗnde ina waɗi 3-dehidro-20E-20E (Fo-20E)3 (20E22P).Tiiɗnaare maande HPLC-MS/MS 3D20E22P ko limre ɗiɗi ɓurnde toowde e mbaadi mum defosforilaasiyoŋ, 3D20E, e limre tati ɓurnde E e 20E (Natal 1.).Hay so tawii e nder nokkuuji goɗɗi e ɓanndu nduu; Fig. 1a).Min ƴeewtindiima kadi ekdisteroid e nder worɓe e rewɓe udditaaɓe keso (<1 ñalawma) e min njiyti 3D20E e 3D20E22P tan e nder MAG ; E, 20E e 20E22P ina tawee e jinnaaɓe ɗiɗo ɓee fof (Dowlaaji yaajɗi Fig. 1b).Ɗeeɗoo doosɗe ina kollita wonde worɓe mawɓe A. gambiae ina peewna tiitooɗe toowɗe hormonuuji baylotooɗi e nder MAG mum en ɗi rewɓe sinndataa.
MAG e LRT debbo (ina heen atriya, ɓuuɓri ƴiiƴam, e parovarium) ƴettaa ko e worɓe jommbaajo balɗe 4 (balɗe 4) e rewɓe jommbaajo e jommbaajo (0,5, 3, e 12 hpm).Ekdison e nder ɗeen ƴiye ƴeewtaama e HPmeLCan sempaired, t2 njuuteendi yiytugol (FDR) feewnaama; NS, alaa ko nafata; *P < 0,01 .3D20E: waktuuji 3 e waktuuji 0,035; waktuuji 12 e waktuuji 0,002 . 3D20E22P: waktuuji 3 e waktuuji 0,5, P = 0,25; waktuuji 12 e waktuuji 3, P = 0,0032; waktuuji 12 e waktuuji 0,015).Dowlaaji ɗii ko e limtooji biyoloji tati limtaaɗi ɗii ɓowɗi.Ekdison ina hollira e mbaydi nii: E, ɓaleejo; 20E, ko oraas; 20E22P, ko ɓaleejo; 3D20E, ko bulo; 3D20E22P, pink.Inset ina ɓeyda njuuteendi e dow y-axis ngam hollirde tolnooji ekdison les.
Ngam wiztude so tawii 3D20E22P e 3D20E ina mbayloo e nder njilluuji, min njuurnitii LRTs rewve e sahaaji ceertuzi caggal njilluuji.Hay so tawii ekdison tawaaka e sukaa6e 6ee, min teskiima 3D20E22P keewzo e nder LRT ina njillondiri e h5ma (h5ma) ɗoon e ɗoon caggal h5ma wakkati, tawi toɓɓe 3D20E ɓeydiima no feewi (Natal 1).Kuutoragol 3D20E sintetik kemikal ko no mbaydi, min teskii wonde toɓɓe ooɗoo hormon steroid e nder LRTs jokkondire ko famɗi fof laabi 100 ɓuri 20E (Tablo Dowlaaji Yaajɗi 1).Ko noon, ma 3D2one is LRT debbo e nder jokkere enɗam, e mbaadi mum defosforilaasiyoŋ, 3D20E, ina heewi no feewi ko juuti caggal jokkere enɗam.Ɗum ina hollita darnde teeŋtunde wonande ekdison cakkitiiɗo oo e nder biyoloji debbo caggal jokkere enɗam.
Caggal nde min peewni mbaydi kesiri RNA (RNA-seq) (Natal 2a), min kuutorii ko mbaydi bioinformatik mahndi, min njiyti ekdison kinaase (EcK), ekdison oksidaas (EO), e ekdison koddiroowo 20E-modified phosfatase identite.EPP) Taƴre EPP e taƴre EcK ɗiɗi potɗe (EcK1 e EcK2), kono mbaawaano yiytude taƴre EO moƴƴere.Teskaama, taƴre EPP gooto gooto ina feeñnina e tolnooji toowɗi (98,9 e nder teemedere) e nder MAGs Gammbi kono wonaa e LRTs rewɓe (Natal 2b), ko luutndii ko min cikkunoo sinP2 ooɗoo ƴiiƴam debbo.Ko ɗum waɗi, eɗen cikki wonde EPP gorko ina waawi wayleede e nder jokkere enɗam.Ndeke, en kuutoriima in vivo stable isotope labeling ngam maskude protein debbo caggal jokkere enɗam, enzim mo MS anndi e nder atrium debbo (Fig. 2c e Tablo ɓeydaango 1)). tabitinaama e huutoraade antibiotik keeriiɗo (Natal 2d).
a, Pipeline bioinformatique mahaaɗo e dow yamiroore ngam yiylaade ƴiye jibinannde kala jinnaaɗo ngam yiytude taƴe gonɗe e EcKs, EOs, e EPPs.Limooje gonɗe e saraaji ƴiye ɗee ina kollita limoore kanndidaaji worɓe e rewɓe e kala daawal (Ngolɗoo wiɗto hollitii taƴre EPPE wootere e taƴre wootere exKK1) worɓe, e taƴre EcK wootere (EcK2) peeñnde e nder jinnaaɓe ɗiɗo ɓee fof kono nde rokkataa taƴre EO kanndidaa.b, Heatmap ina nanndi e peeñgol taƴre kanndidaa e nder ƴiye jommbaajo (V) e jommbaajo (M) Anopheles gambiae e Anopheles albicans.Spca, jibinannde; MAGs, ko ƴiye kuutorteeɗe e worɓe ; terɗe ɓanndu goɗɗe, ko wayi no ƴiye, baagal, koyɗe, ɓalli ɓuuɓɗi, e terɗe ndernderiije e nder jinnaaɓe ɗiɗo ɓee fof, e ƴiye e nder rewɓe.EcK2 ina feeñi no feewi e nder MAG e atria Gammbi fof, tawi noon EPP ina tawee tan e MAG.c, Analyse proteomique de la groupe transloriama femmele at2, at2 hpm, holliroowo 67 poroteyiin ɓurɗo heewde.Rewɓe ɓee njibinaama e ñaamdu tawa ina waɗi 15N ngam limtude (e maskude) poroteyiinuuji ɗii fof.Workooɓe ɓe limtaaka ɓee njibinaama e rewɓe limtaaɓe ɓee, LRT rewɓe ɓee njuurnitee ko e 3, 12 e 24 hpm ngam ƴeewde doggol proteomik Supplementary for Table a1 proteins).Inset, EPP, Eck1 e EcK2 njiytaama e MAG worve jommbaajo e ƴeewndo proteomik e ɗeen ƴiye.d, EPP yiytaa ko e western blot e nder MAG e LRT rewɓe jommbaajo, kono wonaa e rewɓe jommbaajo walla worɓe walla heddiiɓe e ɓanndu debbo jommbaajo anti-EPP antibodies.Worɓe fof ko sukaaɓe rewɓe.Ƴeew natal ɓeydaande 1 ngam humpitaade iwdi gel.Western blots mbaɗaa laabi ɗiɗi e njeñtudi nanndundi.
Kuugal fosfosfataas ekdisteroid EPP hoolkisaama caggal nde ngal ɓuuɓnaa e HPLC-MS/MS e 3D20E22P ceertuɗo e MAG (Data yaajɗo Fig. 2a).Ko adii fof, nde min muumɗini EPP e mbaydiiji gonɗi e nder RNA (RNAi), min njiyti ustaare tiiɗnde e mafase e nder 1990 (Natal 3a), e rewɓe jokkondirɓe e worɓe muusɓe EPP kollirii ko heewi A les ɓuuɓri 3D20E defosforilaasiyoŋ (Natal 3b) hay so tawii ko feccere e silsil taƴre (Dowlaaji yaajɗi Fig. 2b,c).E nder ko feewti heen, en njiytaa waylooji mawɗi e nder saP/E2me2es e nder 2/E,20 ina hollita wonde enzim oo ko keeriiɗo e 3D20E22P (Natal 3b).
a, Ustagol golle fosfataas e nder MAG saabiima silsil EPP huutoraade ARN EPP mo mbaydiiji ɗiɗi (dsEPP) walla ARN GFP mo mbaydiiji ɗiɗi (dsGFP) ƴeewndorɗe.Pooluuji MAG capanɗe ɗiɗi kuutoraama e kala rewtinnde (P = 0.0046 seppooji, doles ɗiɗo, t-parat.d gonnduɗo e worɓe silminaaɓe EPP ina njogii 3D20E defosforilaat ɓurɗo famɗude e 3 hpm (P = 0,0043, t-test mo alaa ko jokkondiri, banngeeji ɗiɗi), tawi noon toɓɓe 20E ɗee meeɗaani (P = 0,063, ɗe njokkondirtaa). t-test, banngeeji ɗiɗi).Dowlaaji ɗii kolliraama ko no mbaydi ± sem ummoraade e poolguuji tati 13, 16 e 19 rewɓe gooto heen fof.c, Rewɓe jibinirɓe e worɓe silɓe e EPP ina njogii tolnooji ɓurɗi heewde e jibinde (P = 0.0002, jarribo Fisher laaɓtungo e ngonka mum en to banngeeji ɗiɗi; Balɗe 2 caggal ɗuum, ɓe njokkondiri e worɓe woɗɓe jogiiɓe ƴiiƴam mbaylaaɗam ngam ƴeewde tolno jibinannde rewrude e ƴeewndo PCR keewngo mbaylaandi.d, Rewɓe ñamlaaɓe ƴiiƴam njibinaama e worɓe muusɓe EPP ina usta jibinannde no feewi (P < 0.0001; Mann-Whit-Whitney numberly = slight test, ɗiɗo 0.088, jarribo Mann-Whitney, banngeeji ɗiɗi) , tawi noon keewal jibinannde mettinaani (P = 0.94, jarribo Fisher laaɓtungo, banngeeji ɗiɗi).E nder panneeji ɗii fof, n ina hollita limoore ƴeewndorɗe ɓowɗi keɓtinaaɗi e biyoloji.NS, alaa ko maantini.*P < **P <,0.0,1.05. ****P < 0,001.
Ko adii, min ƴeewtii so tawii defosforilaasiyoŋ ekdison ina jogii nafoore ngam saabaade reentaade jokkere enɗam e nder rewɓe.Teskaama wonde rewɓe jokkere enɗam e worɓe ɓe EPP mum en ŋakki ina njiytoo jokkere enɗam e nder keewal ɓurngal heewde (44,9%) e rewɓe ƴeewndotooɓe (10,4%) so ɓe njiydii e ɓeydagol (transgenic aservcase) worɓe jibinannde (Natal 3d, nano) e ustaare seeɗa e limoore egguuji ɗi ɗiin rewɓe njibini (Natal 3d, hakkunde), tawi noon teemedere egguuji ɗi rewɓe njibini (jaabawol goɗngol ngol rewɓe ɓee njibini e njiimaandi )) mettinaani (Natal 3d, nyaamo ɗii).Given the obD,P2 results). ina hollita wonde huutoraade 3D20E e EPP gonɗo e nder jokkere enɗam ina waawi jogaade darnde teeŋtunde e ittude jaɓɓugol debbo ngam ɓeydaade jokkere enɗam, jikku mo meeɗaa siforaade e jokkere enɗam 20E .Ko ɗum waɗi, ooɗoo hormon keeriiɗo worɓe kadi ina toɗɗii jibinannde debbo no feewi.
Ko adii ɗuum, en njuurnitii golle 20E e 3D20E e nder jarribooji injection e nder sukaaɓe rewɓe jom en hakkillaaji en kuutortooɗi 3D20E sintetik kemikal (Natal 4a–c) e 20E keɓaaɗo e njulaagu.En teskiima wonde 3D20E ina heewi ɓuuɓde e ma offsensitivit e fe 20 (Natal 4d).Teskaama, feccere e tolno fijirde 3D20E e nder LRT (1 066 pg caggal njuvvudi vs. 2 022 pg caggal njuvvudi) ina addana zum heewde e rewve refrakteeruuji ko ina tolnoo e 20-fol toɓɓere fijirde 20E caggal njuvvudi2 (ho1g3in) ko ɓuri heewde e 18 pg caggal jibinannde ; Tablo Dowlaaji Yaajɗi 1).Ngolɗoo laawol ina yahdi e miijo wonde mbayliigu 20E e nder jibinannde addantaa ɗum en sahaaji gonɗi e jokkere enɗam, e ɓeydaade hollude wonde 3D20E ko huunde mawnde e tabitinde jokkondiral jibinannde e sukaaɓe.3D20E kadi ina ɓuri 20E huutoraade no feewi e nder egg-assays the4). limre egg-laying no woorunoo nde min teskii caggal silsil EPP feccere, ko sabu woodgol golle 3D20E heddiiɗe ɗe geɗe rewɓe baɗaaɗe e Mating peewnata haa jooni.
(a,b) 3D20E sinndaama e kemikal gila e 20E (a) e waylo-waylo/nafoore toownde no feewi (doggi peeñninaama ko no mbaydi ± sem ummoraade e reaksiyoŋaaji sinndagol tati keertiiɗi) (b).c, Spektro masse (feccere les) ina nanndi no feewi e ekdison tawaaɗo e LRT debbo jommbaajo.3g.3g with,P02 0,02; 0,21 μg, P < 0,0001; jarribo Fisher laaɓtungo, banngeeji ɗiɗi) e 10% etanol (0,63 μg, P < 0,0001; 0,21 μg, P < 0,0001 tan, jarribo Fisher ɓuri toowde e 0,0001 doseeji ɓurɗi mawnude (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; jarribo Fisher laaɓtungo, 2-bannge).e, 3D20E injection ina addana jibinannde ɓurnde mawnude e nder rewɓe jommbaajo ko ɓuri 10 μg, P = 0.000). 0,13 μg, P = 0,0003; jarribo Fisher laaɓtungo, banngeeji ɗiɗi), tawi 20E ina renndini e ƴeewndorɗe Ko e doseeji ɓurɗi toowde tan (0,21 μg, P = 0,022; 0,13 μg, P = 0,0823 banngeeji ɗiɗi exa2d limtooji jibinannde ko ɓuri 20E e doseeji ɓurɗi toowde (0,21 μg, P = 0,0019; 0,13 μg, P = 0,075; jarribo Fisher laaɓtungo, banngeeji ɗiɗi).E nder panneeji ɗii fof, n ina hollita limoore sampleeji ɓowɗi ɗi ngalaa sifaa biyoloji,***P, wonaa <0.0.0.0. ***P < 0,001, ****P < 0,001.Dowlaaji ɗii ko e limtooji tati.
E nder wiɗtooji ɓennuɗi, en teskiima wonde mbayliigu hormonuuji steroid ina addana feeñninde MISO (Stimulateur d’Oogenesis 11), woni taƴre jibinannde debbo, reennde rewɓe A. gambiae e ñawu P. falciparum importation Coodguuli cellal saabiiɗi 13, ko ɓuri maayde e malaria paraG fitness of Anopheles e nokkuuji ɗo paawngal woni ɗoo, min pellitii anndude hol hormon 3D20E walla 20E ummotooɗo feeñninde ooɗoo taƴre.Min tawii wonde so tawii 20E injection teeŋtuɗo walla ɓurɗo waawde ina addana won e ƴeewndorɗe hormon nukliyeer (HR), ko wayi no HR3 e HR4, e tipikal susteroid dow taƴre Vg14, 15, 16, MISO ɓuri semmbe ko 3D20E addani ɗum (Extended Data Fig. 3).Nii woni, mbayliigu nguu e nder jokkere enɗam e ooɗoo hormon steroid androgenic ina wayi no ina addana ɗum en waɗde feere ngam reende rewɓe e njoɓdiiji ɗi ñawu nguu addanta ɗum en E jaɓɓotooɗo EcR, ina addana EcR-A e reentaade EcR-B, e ɓurde semmbe ustude taƴe goɗɗe jibinannde jibinannde, ina heen HPX15, ko ɗum addanta jibinannde debbo.Ɗum ina waawi saabaade ŋakkeende jibinannde mawnde yiytaande e rewɓe jibinannde e worɓe EPP-silence dow ɓuri waawde huutoreede ko e hormonuuji ɗiɗi ekdison baawɗi wonde les golle keertiiɗe e jinnaaɓe.
Ko adii, min ƴeewtii golle taƴe ɗiɗi EcK cifaaɗe e nder laylaytol men bioinformatique.Silencing EcK1 walla EcK2 addani maayde mawnde e worɓe (Extended Data Fig. 4a), ina hollita wonde fosforilaasiyoŋ ekdison, e noon kadi inaaktiwiteede, ina waɗi nafoore ngam wuurde.Sabu EcK ɓuri toowde e toɓɓere EcK e nder MAGs e proteomics (Natal 2b,c e alluwal ɓeydaande 2), min teskiima golle mum ekdisteroid kinaase e ɓuuɓnude ɗum e 20E, ko ɗum addani fosforilaasiyoŋ 20E22P (Dowlaaji yaajɗi Natal 2).4b).Nde min kuutorii 3D20E ngam deƴƴude geɗel 3D20E22P (Dowlaaji yaajɗi Fig. 4c), ina hollita wonde 20E wonaa 3D20E ina waawi wonde paandaale ɓurɗe yiɗeede e EcK2.
E fawaade e wiɗto men RNA-seq, EcK2 ina feeñi kadi no feewi e LRT rewɓe jommbaajo, ɗo ɗum udditaa caggal nde njibinaa (Natal 2b).En teskiima ɗeen dokke, en teskiima wonde feeñninde EcK2 ina mettina e ñamri ƴiiƴam (Dowlaaji Yaajɗi Fig. 5a).Yaajnude peitii men e nder 20E22P ina ɓadii no feewi e tolno 20E (waktuuji 22-26 caggal ñaamde ƴiiƴam; Dataaji yaajɗi Fig. 5b).Siltugol EcK2 e nder rewɓe jommbaajo ina addana ɓeydagol laabi 3 e nder njuuteendi 20E e 20E22P EcK2 kadi ina fosforila 20E e nder rewɓe.Teskaama, sukaaɓe rewɓe ɓe EcK2 ŋakkiraaka ina njogii jaɓɓugol timmungol (Extended Data Fig. 5d,e), ina ɓeyda heen wonde peewnugol rewɓe 20E addantaa ɗum en dumunnaaji refractory jokkondire.Kono noon, ɗiin rewɓe ina ɓeydoo heewde e jokkondire ko ɓuri 30% e sukaaɓe rewɓe liggotooɓe egguuji (Extended Data Fig. 5f).So tawii injections Eck2 RNA (dsEcK2) gonɗe e mbaydiiji ɗiɗi mbaɗaama caggal nde ƴiiƴam ñamli, jibingol waɗaaka, e oon sahaa 20E peak sabu ƴiiƴam ɓuuɓɗam ina ustii caggal ballal ƴiiƴam.Overall thatE can njibinagol, kono tan nde bolol njibinagol ngol (EcK2 e ko waawi wonde fof geɗe goɗɗe) muumtaama e njibinagol.Injections 20E walla 3D20E ina kaɗa EcK2 feeñde e sukaaɓe rewɓe (Extended Data Fig. 5g), ina hollita wonde geɗe goɗɗe ina kaɗa haɗeede bloHover fee kinase ina heewi ngam saabaade mettere e jokkondire, kono ina moƴƴi e tiitooɗe toowɗe 3D20E gonɗe e jokkondire.
Njiylawu amen ina rokka humpitooji teeŋtuɗi e laabi jowitiiɗi e nafoore jibinannde A. gambiae.Model gooto feeñii ɗo worɓe ƴellitii ngam sinkude tiitooɗe toowɗe 3D20E, ekdison baylaaɗo keeriiɗo worɓe, baawɗo tabitinde jibinannde e desensitizing rewɓe ngam ɓeydaade jibinde malaria, ɗiin sahaa kadi ƴellitii malaria activate 3D20E dans les femmes en réponse à la transfert sexuel de l'EPP spécifique au homme.E ganndal men, ko ɗum yeru gadano e mbaydi hormon steroid ɓurndi heewde e worɓe e rewɓe, golloowo golle keertiiɗe e tiiɗɗe e nder ɓowɗi teskagol 18 ngol ko wonde ɗeen golle ina mbaawi waɗeede e 20E precursor E1.Ina anndaa wonde e nder Drosophila, monandry ina ummoo e mbayliigu jibinirgol peptideeji tokoosi19,20 jokkondirɗi e neronuuji gonɗi e nder ƴiiƴam debbo rewrude e signaal jibinannde dow2receptors2 kaskaaji ɗi 3D20E jogori reende e nder rewɓe A. gambiae e ngam anndude so tawii ɗiin kaskaaji ina mbaawi hisneede hakkunde ɓowɗi e Drosophila.
E fawaade e darnde 3D20E teeŋtunde e jibinannde debbo e jikkuuji teskaaɗi e wiɗto men, laabi jowitiiɗi e sintesis e huutoraade 3D20E ina ndokka fartaŋŋeeji kesi ngam peeje haɓaade ɓowɗi garooji, ko wayi no jibinannde worɓe sterile gaadoraaɗe e peeje imita wild insect the U2 virgin play.Golle 3D20E keertiiɗe e worɓe ina mbaawi feeñde nde A. gambiae e mbaydiiji Cellia goɗɗi keɓi mbaawka ɓuuɓnude ƴiiƴam mum en e nder ɓuuɓri gonndi e ɓuuɓri, nde tawnoo ɗuum ina addana ɗum en waɗde jokkondire moƴƴe e hormonuuji keewɗi e enzimuuji gonɗi e hormonuuji (rewrude e baylagol toowngol MISO) ngam wallitde fitinaaji mum en jibinannde e nokkuuji ɗo malaria ɓuri heewde, ko ɗum addanta e nder laawol ngol Plasmodium saabaade.So en ƴeewii wonde debbo 20E hollitaama ina jogii batte luggiɗe e nguurndam e mawnugol hormon P. falciparum e nder hormon Anopheles bo4toid mosqui jooni geɗe teeŋtuɗe e jokkondiral ɓowɗi e parasiit.
A. gambiae G3 ina njibinaa e ngonkaaji mborosaaji (26-28 °C, 65-80% e nguleeki weeyo, 12:12 h fotoperiod annoore/niɓɓere).Larve ina ñamlee e nguura liɗɗi ɓuuɓɗi (TetraMin Tropical Flakes, Koi:7 Pellets e nder7). ɓowɗi ɗii ñamlaama ad libitum 10% dextrose solution e ƴiiƴam neɗɗo yontere kala (komponen ƴiiƴam jannguɗo).Ɓowɗi jommbaajo keɓaama e seerndude jinnaaɓe e daawal pupal caggal nde ƴeewndaa joofnirɗe mum en e mikroskoop.Worɓe jogiiɓe transgene DsRed ina cifaa ko adii.
Jarribooji doole jokkondire mbazaama e fawaade e porotokolle sifotooze ko adii.Ngam jokkondire tawaaze, rewve jommbaajo balze 4 ina njoozee e 1:3 e worve jommbaajo jommbaajo vurzo mawnude e nder jammaaji didi.Ngam jarribooji zi worve ve njibinaama e dsEPP, co-caging phophase a-3 hawri ko e,4 ko ɓuri heewde e silsil (Data yaajɗo Fig. 2b).
Ɓowɗi ɓowɗi, heddiiɓe e ɓalli ɗii (heddiiɓe e ɓanndu nduu), walla ɓanndu nduu fof, njuppaa e 100% e metaan, homogenisee e ɓuuɓri (2 mm ɓuuɓri gilaas, 2 400 rpm, 90 sec).Keewgol ƴiye e njuuteendi metanol ko nii siforii : heddiiɓe e ɓanndu nduu,500. MAG, 50-100 80 ml; female LRT, 25–50 80 μl.Precipitate oo waɗaama e ƴettugol metaan ɗiɗmo e njuuteendi metanol gootol.Debris cellal ittaama e senndifugaasiyoŋ.Metanol ummoriiɗo e ƴettugol ɗiɗmol ngol hawraama, yoora e les ɓuuɓri azot, caggal ɗuum resuspended e nder njuuteendi wa8% 50 μl; MAGs e LRT debbo, 30 μl.
Sammbaaji ɗii ƴeewtaama e dow ƴulɓe (ID-X, Thermo Fisher) jokkondirɗi e kuutorgal LC (Vanquish, Thermo Fisher).5 μl sammbaaji ɗii njuurnitaama e dow koloñaal 3 μm, 100 × 4,6 mm (ndiyam, 0,1% asid formik) e B (asetonitril, 0,1% asid formik).Gradient LC ko nii siforii : 5% B e nder hojomaaji 1, caggal ɗuum ɓeydaa haa 100% B e nder hojomaaji 11.Caggal hojomaaji 8 e 100%, re-equilibrate colonel e%4 ml min-1.Ionizaasiyoŋ e nder ɓuuɓri MS ina heɓee e iyonisaasiyoŋ elektorospray ɓuuɓɗo e mbaadiiji moƴƴi e bonɗi.
Spektromeeter masse ina fota doosɗe e nder m/z tuggi 350 haa 680 e 60 000 resolution e nder mbaadi MS timmundi.Dowlaaji MS/MS keɓaama e [M + H]+ (denndaangal paandaale), [M - H2O + H]+ (paandaale ɗee fof), e [M - H]- (doosɗe ɗe fosforilaaji kuutorteeɗe e fosforilaasiyoŋ MS). ngam anndude ekdisteroiduuji ɗi ngonaa paandaale, dokke MS/MS wonande denndaangal peccitagol HPLC ngol >15% e keewal gonngal e mum ngal ƴeewtaama.Limto huutoraade kurjuruuji paandaale peewnaaɗe e tolnooji laaɓtuɗi (20E, 3D20E) ngam hiisaade keewal timmungal walla dilutions tawaaɗe e nder sample gooto keeriiɗo ngam hiisaade equival mum en gooto keeriiɗo ( gorko.Wonande 3D20E, limto ngoo wazaama e huutoraade limto vurngo moxxude ngo : [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]- spekteeruuji E, 20E e 3D20E njiytiraa ko mbaydiiji mum en.3D20E22P ƴeewtaama e derivatization e reagent Girard.20E22P ƴeewtaama e m/z ratio.
3D20E22P laɓɓinaama e MAG.Laɓɓingol ngol waɗiraa ko e tolno analitik kuutortooɗo kromatogaraaf ndiyam (Acquity, Waters) e detektoor baɗɗo maslahaa (QDa, Acquity, Waters) e nder sarɗiiji LC gooti ɗi analiis HPLC-MS/MS jaabtii 3D20E22P yiytaa ko e sahaa jokkere enɗam hono no anndiranoo adan nii.Ndeen laaɓal mbaydiiji ƴettaaɗi ɗii ƴeewtaama e HPLC-MS/MS no siforaa dow nii.
ARN fof ƴettaa ko e 10-12 ƴiye jibinannde walla geɗe goɗɗe ɓanndu (ɗe ngalaa hoore) e kuutoragol mbaydi TRI (Thermo Fisher) rewrude e jamirooje peewnoowo oo.RNA oo safraama e TURBO DNase (Thermo Fisher). jamirooje peewnoowo oo.Primeruuji ngam PCR limtilimtinoowo mbayliigu (RT-qPCR; Tablo 2) ina njaltinaa ko adii24 walla ina peewnaa e kuutoragol Primer-BLAST26, tawa ko ɓuri yiɗeede ko e geɗe 70-150 bp e mawneeki e njuuteendi jokkondire ekson-ekson to sample Primerc D 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), ɓuuɓri, e 5 μl cDNA ɓuuɓɗo. e dokke ɗe mooftaa, ƴeewtaama e kuutoragol Design and Analysis (version 2.4.3).No holliraa e ndeeɗoo wiɗto nii, keewal gonngal e mbaydi gonndi e taƴre ribosome RpL19 (AGAP004422), nde baylagol mum waylaaki no feewi e ñamri ƴiiƴam 27 walla e jokkondire 3 .
Kalite ARN ƴeewtaama e kuutoragol Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent).Defte Illumina gonɗe e mbaydiiji ɗiɗi peewniraama, dogginaama to Duɗal Jaaɓi-haaɗtirde MIT e Harvard parameters.Janngugol e kalite kartoŋaaji (MAPQ) limtooji <30 ittaama e kuutoragol Samtools (mbaydi 1.3.1).Limre janngugol kartoŋaaji e taƴe limtaa ko e kuutoragol htseq-count (mbaydi 0.9.1) e parametruuji default.Limtooji janngugol no woorunoo hiisaama e ƴeewndo uver 1.28.1) e nder R (mbaydi 4.0.3).
Kanndidaaji taƴe baylotooɗe ekdison njiytaa ko e njiylawu gadano taƴe A. gambiae kuutortooɗe algoritme PSI-BLAST ( https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov. NP_001038956.1), Musca domestica (Nokku keɓgol XP_005182020.1, XP_005175332.1 e XP_011294434.1) e ɓuuɓnoowo Mikroplitis (Nokku keɓgol XP_66.0815 XP_008552645.1) EcK ummoriiɗo e B. mori (Nokku jokkorgal NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nokku jokkorgal NP_651202), Apis mellifera (Nokku jokkorgal XP_394838) e Asirtosip (Nokku jokkorgal XP_394838). XP_001947166); e EPP ummoraade e B. mori (Nokkuure jokkondire XP_001947166) NP_001177919.1 e NP_001243996.1) e EO D. melanogaster (Nokkuure jokkondire NP_572986.1) (toɓɓere 1). pecce/ekson kilobase e nder miliyoŋ jannguɗo kartoŋaaji (FPKM) walla >85%) e nder ƴiiƴam jibinannde (LRT walla MAG debbo) to Gammbi (taƴre 2 ). Ngam ɓeydude keertinagol, min cuɓii enzimuuji kanndidaaji ɗi kadi peeñninaaka e nder ƴiiƴam jibinannde A. albimanus, ko sifaa anofeles mo sinndataa walla waylaaki ekdison e nder jokkere enɗam.Taƴe kanndidaaji ɗii filtiraa ko e tuugnaade e peeñgol tokosol (<100 FPKM walla <85th percentile alssuep.sbimanus) e nder A filtirde sakkitiinde (taƴre 4), taƴe kanndidaaji ina poti weltinde ko famɗi fof gooto e ɗeeɗoo geɗe : (1) ƴellitaade no feewi caggal nde jibinaa (P < 0.05) fawaade e ƴeewndo taƴe peeñɗe ceertuɗe e (2) e nder ƴiye ɗe njibinaaka (< 85 % walla <100 FPKM).
En mbaylii laabi cifaaɗi ko adii ɗii 28,29,30 ngam heɓde limto isotopeeji nguurndam fof.E tonngol, Saccharomyces cerevisiae mbaydi II (YSC2, Sigma) ƴeewtaama e nder mbaydi azot lewru (BD Difco, DF033%), Sigma2vol535, tawa ina waɗi (gluco7%,2) 1,7% ko asid amino e sulfaat amoniyum. mbaydi pinal) e 5% sulfaat amoniyum 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ko kañum tan woni ɓuuɓri azot.Lekki ki heɓtinaama e senndifugo e ɓuuɓri ɓowɗi ina ñamlee ad libitum haa ɗi njibina.Ɓeydagol e mg0 maayde instar nayaɓo.Ko rewɓe tan kuutortenoo e jarribooji jokkondire e worɓe ɓe ngalaa martaba ngam yuurnitaade poroteyiin worɓe gonɗo e jokkondire.
Rewɓe jommbaajo 15N-tagged balɗe 4-6 ndokkaama doole ngam jokkondirde e worɓe jommbaajo mo duuɓi mum en njahdaani.Jokkondire jaajɗe ɗee hoolkisaama e yiytude plugs jokkondirɗe e les mikroskoop epifluorescence.E 3, 12, e 24 hpm, atria rewɓe 45-5 dicedted into5 tampon bikarbonaat amoniyum (pH 7,8) e homogeniseede e pestle.Homogenaaji ɗii njuppaa e ɓuuɓri ndii, ɓuuɓri ndii jillondiraa e 50 μl e pellet RapiGest 0,1% (186001860, Ndiyam) e nder 50 mM bikarbonaat amoniyum e sample neldaama jamma to laboratuwaar MacCoss to duɗal jaaɓi haaɗtirde Washington, ɗo peewnugol sample ngam LC-MS/MS timmi.Resuspend pellet e nder 50 μl 0.1% RapiGest e nder 50 mM bikarbonaat amoniyum e sonicate e nder lootorde ndiyam mM ditiyotreitol (DTT; Sigma), alkilaama e 15 mM yodoasetamid (Sigma) e ɓuuɓnaama e 37 °C (1:0 50) fotde waktu 1 e tiripsinisaasiyoŋ : njuuteendi tiripsinisaasiyoŋ: njuuteendi tiripsinisaasiyoŋ).RapiGest limtaama e ɓeydugol 200 mM e nder HC5l senndifugaasiyoŋ e 14 000 rpm fotde hojomaaji 10 e 4 °C ngam ittude mborosaaji.Sammbaaji ɗii loowaama e ƴettugol faɗo tiiɗngo (kartuɗe Oasis MCX, Ndiyam) e 0,1% e asid formik ngam heɓde ɓuuɓri poroteyiin timmundi 0,33 μg μg MbeleldU ko noon kadi ƴeewndaa e worɓe jommbaajo.Replikaaji ɗiɗi ƴeewndorɗe ƴeewndaama e kala sample.Ko adii ɗuum, 1 μg e kala heen ƴeewtaama e kuutoragol koloñaal 75 μm silis ɓuuɓɗo 25 cm e silis ɓuuɓɗo Kasil1 (PQ) frit trap pa-1 (Phenomenex) e 180 minit e mbaydi ndiyam. Digesteeji sample – MS/MS dogginaama e dow spektoromeeter mass HF Q-Exactive (Thermo Fisher) e Siistem UPLC nanoACQUITY (Ndiyam).Doggi keɓgol jowitiiɗi e doosɗe peewnaaɗe e kala doggol mbaɗtaama e mbaadi mzML e kuutoragol Proteowizard (mbaydi 3.0.2028) Data FASTA ina waɗi jokkondire poroteyiin ummoriiɗe e Anopheles gambiae (vectorBase mbaydi 54), Anopheles coluzzi Njiylawu waɗaama e Mali-NIH (mbaydi VectorBase 54), Sakkaromiis cerevisiae (Uniprot, marse 2021), A FDRs nannduɗi e kartal peptideeji peeñninaama e kuutoragol Percolator32 (mbaydi 3.05) e limre 0.01, e peptideeji mooftaama e anndinde poroteyiin kuutortooɗi parsimony poroteyiin e nder Limelight33 (mbaydi 2.2.0). e nder kala doggol no siforaa adan nii.NSAF fawaade e kala poroteyiin ina hatojini e nder sampleeji ummoraade e mbaydiiji biyoloji ɗiɗi ceertuɗi.15N limto ngoo ina waawi maskude poroteyiin debbo oo, hay so tawii noon ko seeɗa e poroteyiin mo limtaaka ina waawi yiyteede e sukaaɓe rewɓe limtaaɓe ɓee.Min mbinnditii ustaare poroteyiin worɓe tan e nder spectra fema1 doggi karallaagal, ɗo seedanteeje raw dogaa caggal seedanteeje worɓe/jokkondire, ko batte HPLC “carry over”.Proteinuuji sahaa e sahaa fof tawaaɗi ko ‘contaminants’ ummoriiɗi e sukaaɓe rewɓe markeeji ina limtaa e alluwal ɓeydoowal 1.
Peptideeji ɗiɗi antigenik, QTTDRVAPAPDQQQ (nder isotip PA) e MESDGTTPSGDSEQ (nder isotip PA e PB) e nder Genscript.Peptideeji ɗiɗi ɗii kawraa, caggal ɗuum njiytiraa poroteyiin joloowo KLH, njuppaa e nder ɓowɗi Nuwel Selannde e laɓɓingol affiniteer.IgG ummoriiɗo e mboros ɓurɗo teeŋtude e EPP huutoraa ko ngam ɓeydaade waɗde western blotting.
Wonande western blots, MAG (n = 10, ɗo n woni limoore sampleeji ɓowɗi ɗi ngonaa biyoloji) e LRT debbo (n = 30) ummoraade e worɓe jommbaajo balɗe 4 e rewɓe jommbaajo walla jommbaajo doole (<10 caggal jommbaajo), tampon ƴettugol poroteyiin (50 mM. NP0; 50 mM Tri-NPs; 0,25% deoksikolaat sodium;150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktel cemmbinoowo protease (Roche)) ɓeydaama heen seeɗa seeɗa 000 g e 4 °C.Proteinuuji ɗii limtaa ko e ƴeewndo Bradford (Bio-Rad).Ndeen, 20 μg poroteyiin MAG, 40 μg poroteyiin LRT, e 20 μg poroteyiin bulk heddiiɗo oo, mbaylaama, seerndaama e 10% BiProin MOTrisPA Ɗemɗe ɗee loowaama laabi ɗiɗi e nder 1× PBS-T (0,1% Tween-20 e nder PBS) caggal ɗuum ɗe ndartinaa e tampon ɓuuɓɗo Odyssey (Li-Cor) fotde waktu gooto e 22°C antibiotik poliklonaal gadano (1:700 e nder tampon ɓuuɓɗo) e antibiotik gadano monoklonaal anti-aktin rat MAC237 (Abeam; 1:4,000).Membraneeji ɗii loowaama e PBS-T, caggal ɗuum njuppaa e antibiotik ɗiɗaɓo (antibiotik puccu 800CW walla ngaari-8th 1:20,000) e nder tampon ɓuuɓɗo ina waɗi 0,01% SDS e 0,2% Tween -20 fotde waktu 1 e 22 °C.Membraneeji ɗii loowaama e PBS-T, ƴettaa e natal e skanndeer Odyssey CLx.Nate ɗee mooftaama, njuɓɓinaama e nder Image Studio (mbaydi ERA keeriiɗo kDa) yiytaaka.
Nokkuuji koddirooji EPP (hono isoforme AGAP002463-RB ina waɗi domen fosfataas histidin, njiylawu domen NCBI keɓaaɗo 34) e EcK2 (AGAP002181) njiytiraa ko e pilaasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) ; primeruuji ɗii limtaa ko e alluwal 2.Jokkondire GS4 jeetati (e nder tandem) naatnaa ko adii C-terminal 6xHis tagɗo pET-21a(+)-EcK2 NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs).Protein gonɗo e ƴellitde dihidrofolaat reduktaas (DHFR) feewnaama e kuutoragol mbaydi ADN ummoraade e mbaydi sintesis poroteyiin E. coli mo alaa ko woni e mum.
Kuutoragol fosfataas EPP e ƴiiƴam ƴiiƴam fotnoo ko huutoraade fosfaat 4-nitrofenil (pNPP; Sigma-Aldrich).Tampon reaksiyoŋ oo ina waɗi Tris 25 mM, asid asetik 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl mM1, mED1, 0 homogenized e nder tampon reaksiyoŋ e ɓuuɓri cellal ittaama e senndifugaasiyoŋ.Fuɗɗoode reaksiyoŋ oo ko e ɓeydude enzim walla ƴiiƴam e nder tampon reaksiyoŋ ina waɗi 2,5 mg ml-1 pNPP 405 nm e sahaaji ceertuɗi.
Ngam golle EcK e nder geese, poroteyiin oo ina ɓuuɓnee e 0,2 mg 20E walla 3D20E e nder 200 μl tampon (pH 7,5) ina waɗi 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP e 10 mM MgCl2 e 2 h 800 μl metanol, caggal ɗuum ɓuuɓnaa e -20 °C fotde waktu gooto, caggal ɗuum ɓuuɓnaa e 20 000 g fotde hojomaaji 10 e 4 °C.Ndeen ɓuuɓri ndii ƴeewtaama e HPLC-MS/MS.Ngam heat-inactive poroteyiinuuji kuutorteeɗi e nder fedde toppitiinde ndee, poroteyiinuuji ɗii njuppaama e nder glycu% PBS2ol min e nguleeki 95°C.
Ngam golle EPP e nder geese, poroteyiin oo ina ɓuuɓnee e 3D20E22P (ko foti no keewal tawaangal e 18 paɗe MAG, laaɓtuɗe e HPLC-MS/MS) e nder 100 μl tampon (pH 7,5) ina waɗi 25 mM Tris, 50 mM asid Bi5M m50 NaCl, 0,1 mM EDTA, e 1 mM DTT fotde waktuuji 3 e 27 °C.Reaksiyoŋ oo dartinaama e ɓeydugol 400 μl metaan, ɓuuɓnaa e -20 °C fotde waktu gooto, caggal ɗuum ɓuuɓnaa e 20 000 g e nder hojomaaji 10.
Feccere PCR ngam EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) e EcK2 (556 bp) ina ɓeydee e ADN peewnaaɗo e ɓalli ɓowɗi ɗi ngalaa hoore jillondirɗi pCR2.1-eGFP; Primeruuji PCR ina limtaa e alluwal 2.Feccere PCR ndee naatnaa hakkunde ƴellitooɓe T7 mbayliigu e dow pilaasmid pL4440.Konngi pilaasmid keɓtinaama e E. coli baawɗo NEB 5-α (New England Datasert Biolabs) e hoolkisaade e jokkondire ADN ngam jokkondire DNA ko adii nde kuutortee (sese1). to ƴellitoowo T7 (Tablo 2) kuutoraa ngam ɓeydude naatgol ngol e nder pilaasmid baɗaaɗo e pL4440.Mawnugol geɗel PCR ngol ina tabitinaa e elektoroforesis gel agarose.dsRNA ina winndaa e mbaydiiji PCR kuutortooɗi Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) e laɓɓingol teskuyaaji siifaama.
Ngam ƴettude dsRNA, 1 380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ƴettetee ko e 10 ng nl-1 e nder reedu worɓe mawɓe walla rewɓe (Nanoject III, Drummond) e nder ñalawma gooto caggal nde ƴettugol ngol waɗi e nder ñalawma gooto Ittugol ARN, sintesis cDNA, e RT-qPCR.Ngam ƴettude ekdison, rewɓe jommbaajo balɗe 4 walla jommbaajo balɗe 6, jom en ƴiiƴam, ina njuutee e 0,13, 0,21, walla 0,63 μg 20E walla 3D20E, D230E e Nanoject1 (Nanorum1). no fotiri fof, fawaade e peewnugol jarribo ngoo walla 6,3 ng nl-1.Innirde 100 nl etanol 10% (vol/vol) e nder ndiyam ; 100 nl 3D20E22P e nder 10% etanol (fotde 75% e keewal tawaangal e nder MAGs).
Ngam ƴeewde jibinannde, rewɓe balɗe 3 ina ñamlee ad libitum e ƴiiƴam aadee.Ittugol ɓowɗi ñamlaaɗi seeɗa walla ɗi ñamlaaka.Fawaade e safaara, rewɓe ina mbaɗee e nder koppi jibinannde ceertuɗi fotde jammaaji nay ko famɗi fof waktuuji 48 caggal nde ƴiiƴam ɗam ñamlaa.S eggs were80); wonande rewɓe jommbaajo, egguuji jibinaaɗi e ƴiye ina njiytee ko ina njibina.
Ngam jarribooji jokkondire, rewɓe ina njaɓa ko famɗi fof balɗe 2 fawaade e safaara ngam ƴellitde reentaade jokkondire, caggal ɗuum worɓe laddeeji gonɗi e duuɓi mum en ina naata e nder cage gooto.Jammaaji ɗiɗi caggal ɗuum, ɓuuɓri debbo jibinaaɗo oo ƴettaa, contai buffer genomic free a DNA ina yaltinee e 1.1 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, e 25 mM NaCl (pH 8,2).Eɓɓooje ɗee njuumtaama e nder Proteinase K (0,86 μg μl-1) fotde hojomaaji 15 e nguleeki 55 °C, caggal ɗuum ko hojomaaji 10 e nguleeki 95 °C yiytude jokkondire kromosom Y ; primeruuji ina limtaa e alluwal 2.Aɓɓugol jokkondire kromosom Y ina hollita alaa ko jokkondiri.
Ngam ƴeewde jokkere enɗam, rewɓe jokkere enɗam doole ƴeewtaama ngam anndude so ina woodi ɓuuɓri jokkere enɗam ngam tabitinde ngonka jokkere enɗam, ɓe ndokka balɗe 2 ngam ƴellitde jokkere enɗam tawa worɓe ngalaa, hono no siforaa adan nii 36 .Worɓe jogiiɓe DsRed transgenic sperm la fertilizing,T ɓuuɓri ndii ƴettaa e rewɓe ɓee, ADN genomik oo feewnaa no siforaa dow nii, waɗtaa e ƴeewndo qPCR transgene DsRed ; primeruuji ina limtaa e alluwal 2.Waasde transgene DsRed hollitii wonde alaa fof jokkondire keɓtinaaɗe.
3D20E sinndaama no siforaa adan nii 37 .E tonngol, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) ɓuuɓnaama e 10 ml ndiyam, rewi heen ko ɓeydugol 30 mg ɓaleejo platinum (e mbaadi pooɗal, Sigma-Aldrich). ɓuuɓnaama e nguleeki suudu.Caggal waktuuji 6, 30 mL metanol ɓeydaama ngam dartinde ɓuuɓri ndii.Nguurndam ɗam ɓuuɓnaama ngam ittude ɓuuɓri katalis.Supernatant oo ɓuuɓnaama haa yoori e nder vacuum e nguleeki suudu.Geɗel ɓuuɓngel ngel ɓuuɓnaama e ethanol e%MShan-0 analysis.Njaajeendi waylo-waylo (gila 20E haa 3D20E) ina tolnoo e 97% (Natal 4b), e mbaydi MS 3D20E sinndaandi ndii ina nanndi e ndi tawaa e rewɓe jommbaajo (Natal 4c).
Lefol ngol ina waɗi defte keertiiɗe e jarribooji limtooji baɗaaɗi ɗii.GraphPad (mbaydi 9.0) huutoraa ko ngam waɗde jarribo Fisher laaɓtungo, jarribo Mantel-Cox, e jarribo t-Student.Teskuyaaji Cochran-Mantel-Haenszel mbaɗaama e kuutoragol binndol R keeriiɗo (ina heɓoo e https://github.com/duopeng/mantelhaen.test).Peccitagol doosɗe ɗee ƴeewtaama ngam anndude so tawii ko no woorunoo e huutoraade jarribo Shapiro-Wilk e tolno maantinɗo 0,05.Nde doosɗe ɗee njaltii e jarribo no woorunoo, jarribo Mann-Whitney waɗaama.Dowlaaji nguurndam ƴeewtaama e kuutoragol patel.ES2q 1.28.1) huutoraama ngam waɗde ƴeewndo baylagol feere to bannge taƴre RNA-seq.Bar horizontal e dow graphique ina hollita median.Nafoore maantinnde P = 0.05 huutoraama ngam wonde limre jarribooji ɗii fof.
Ngam heɓugo bayaanuuji feere dow taskaram jannde, laaru abstract Rapport Wiɗito Nature jokkondirnde e ndee winndannde.
Dowlaaji proteomik MS ndartinaama e nder fedde ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) rewrude e lowre gollodiiɓe PRIDE (https.ebi.ac.uk/pride/) tawa ina waɗi anndinoore doggi PXD032157.
Koolol RNA-seq ngol ina joɗɗinaa e defterdu kuuɓtodinndu baylagol taƴe (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) e les njiimaandi GSE198665.
Ɓeydagol dokke peewnaaɗe e/walla ƴeewndaaɗe e nder wiɗto jooni ngoo ina mbaawi heɓeede e binndooɓe jowitiiɓe heen so tawii ko e ɗaɓɓaande laaɓtunde.Ndee winndannde ina rokka dokke iwdi.
De Loof, A. Ekdisteroid: Steroyid jibinirgol ɓowɗi ɗi njiɗaa?Gorko: Kaɓirgal ɓalewal.Ganndal ɓowɗi.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdison e ƴellitaare ƴiiƴam e nder ƴiiƴam ƴiiƴam.J. Fisiyoloji ɓowɗi.28, 97-109 (1982).