Sortugol poroteyiin e nder laawol gonngol e nder ɓalndu ina foti wonde huunde himmunde ngam hisnude jokkere enɗam e homeostasis. Gaa gaa senngo gonngo e nder ɓalndu, darnde lipiduuji e nder senngo kinesin e nder golle jolngo seerndi ko naamnal juutngal, ngal jaabaaka tawo. Ɗoo, eɗen mbaɗa 3D e sahaa gooto, e sahaa gooto, e nder sahaa gooto, e nder sahaa gooto, e nder nguurndam, wonde poroteyiinuuji kesi sinndaaɗi glikosilfosfatidilinositol-immobilized jogiiɗi pecce lipid seramide juutɗe no feewi ina njuɓɓinee, ina njuutee e endoplasmaaji keertiiɗi Net usembrane protein ceertuɗo e nokku yaltirɗo transmbraned, ko ɗum woni. Yanti heen, eɗen kollita wonde njuuteendi cakkital seramiid e nder ɓalndu retikulum endoplasma ina tiiɗi e ngool suɓagol sortugol. Wiɗto men ina rokka seedeeji gadani laaɓtuɗi e nder nguurndam ngam renndinde karte poroteyiin tuugiiɗe e njuuteendi caɗeele lipid e nder nokkuuji cuɓaaɗi e nder laawol gonngol e nder ɓalndu.
E nder taklon yukariyot en, poroteyiinuuji sinndaaɗi e nder retikulum endoplasma (ER) ɗii, ndeen ina njuurnitee e nder yah-ngartaa rewrude e laawol gonngol e nder ɓalndu ngam nawde ɗum en to nokku mum potɗo e taklon (1). Ko jiidaa e senngo coat-mediated, ina ɓooyi miijaade wonde won e lipiduuji ina mbaawi kadi wonde nokkuuji yaltugol cuɓaaɗi tawa ina moofta ɗi e nder domenaaji membraneeji keertiiɗi ɗi poroteyiinuuji keertiiɗi ɗii (2-5). Kono tan, haa jooni ina ŋakki hujjaaji laaɓtuɗi in vivo ngam hollirde ngool laawol baawngol wonde tuugingol e lipid. Ngam safrude ndee caɗeele teeŋtuɗe, min njanngii e lewru no poroteyiinuuji ankrooji glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) ceertirtee e ER. GPI-APs ko poroteyiinuuji keewɗi jokkondirɗi e lipiduuji ( 6, 7 ). GPI-AP ko poroteyiin gonɗo e nder ɓalndu, jokkondirɗo e leppi yaajɗi e nder ɓalndu, rewrude e feccere glikolipid (ankere GPI). Ɓe njaɓata ko ankereeji GPI ko waylooji caggal firo konservatiif e nder lumen ER (8). Caggal nde GPI-AP jokkondiri, rewata ko e mbaydi Golgi (5, 9) gila e ER haa e mbaydi plasma. Heɓde ankereeji GPI ina addana GPI-AP yahde seertude e poroteyiinuuji gonɗi e nder ɓalndu (ina heen poroteyiinuuji goɗɗi gonɗi e nder ɓalndu) e laawol gonngol e nder ɓalndu (5, 9, 10). E nder ƴiye lewru, GPI-AP ina seerti e poroteyiinuuji goɗɗi gonɗi e nder retikulum endoplasma, caggal ɗuum ina pawee e ɓuuɓri keeriindi, ndi ɓuuɓri poroteyiin coat II (COPII) (6, 7). Ko addani ngalɗoo laawol renndinde e nder golle njulaagu ER laaɓtaani, kono ina teskaa wonde ngalɗoo laawol ina waawi ɗaɓɓude lipiduuji, haa teeŋti noon e mbayliigu mbaydi feccere lipiduuji ankere GPI (5, 8). E nder lewru, mbayliigu lipid GPI fuɗɗotoo ko ɗoon e ɗoon caggal nde GPI jokkondiri, e nder geɗe keewɗe, ina addana seramiid jokkondirde e asid ɓuuɓɗo 26 karbon (C26:0) (11, 12). Ko seramiid C26 woni seramiid mawɗo mo ƴiiƴam leɗɗe peewnata haa jooni. Ina sinndaa e nder ER, ko ɓuri heen heewde ina yaltinee e nder laylaytol Golgi rewrude e ɓuuɓri COPII (13). Eksport ER GPI-AP ina ɗaɓɓi teeŋti noon sintesis seramiid jokkondirɗo (14, 15), e nder ɗuum, waylude seramiid e seramiid inositol fosfaat (IPC) e nder kaɓirgal Golgi fawii ko e sintesis anker GPI (16). Wiɗtooji biyofizik e membraneeji artifisiyel kollitii wonde seramideeji cakkitiiɗi asil juutɗi no feewi ina mbaawi hawrude ngam waɗde domenaaji yuɓɓinaaɗi jogiiɗi sifaaji fisik keertiiɗi (17, 18). Ɗeeɗoo dokke ina ngaddana miijo wonde seramiid C26 e GPI-AP e seramiid C26 ina kuutoroo sifaaji mum en ɓalli ngam hawrude e nokkuuji walla nokkuuji yuɓɓondirɗi e nder nokkuuji lipid ER membrane ɓuuɓɗi. Ko ɓuri heewde e maggal ko gliserolipideeji juutɗi ɗi ngalaa ɓuuɓri (C16:1 e C18:1) (19, 20). Ɗeeɗoo diiwanuuji maa cuɓo e nokkuuji keertiiɗi yaltugol ER (ERES), ɗo GPI-AP baɗaaɗo e seramiid e seramiid mbaawi jokkondirde e Golgi e nder ɓuuɓri COPII gooto keeriiɗo (5).
E nder ndeeɗoo wiɗto, en ƴeewtindiima no feewi ngool laawol tuugorgol e lipiduuji e huutoraade mikroskoop ƴeewndo cellal konfokaal (SCLIM), woni karallaagal mikroskoop kesal baawngal yiytude e sahaa gooto poroteyiinuuji smarked fluorescent Poroteyiinuuji tati e mbaydiiji tati ina njogii ƴeewndo toowngo (3D) (21, 22).
En kuutoriima karallaagal SCLIM ko adii fof ngam ɓeydaade laaɓtinde no GPI-AP no woorunoo e fedde seramide C26 ƴeewtirtee e poroteyiinuuji gonɗi e nder ɓalndu caggal nde yalti ER e nder S. cerevisiae. Ngam ƴeewde senngo ER, min kuutoriima feere renndoyankoore baawnde yiytude no feewi karte kese sinteteeɗe naatɗe e ERES e nder nguurndam (7, 23). Ko wayi no kargo, min cuɓii ko GPI-AP Gas1 baɗaaɗo e seramiid C26, mo poroteyiin ɓuuɓɗo ɓaleejo (GFP) e poroteyiin Mid2 gonɗo e nder ɓalndu, mo poroteyiin ɓuuɓɗo ɓadiiɗo (iRFP) woni, ɗiin ɗiɗi fof ina njiyloo poroteyiin ɓuuɓɗo ɓaleejo (iRFP), ɗiin ɗiɗi fof ina njiyloo poroteyiin ɓuuɓɗo ɓaleejo (24–26). E nder mutant sec31-1 mo nguleeki mum tolnii, ɗeeɗoo karte ɗiɗi ina peeñnina e les njiimaandi (promoteur) gonndi e galaktose e maande ERES gonnde e mbaydi. E nguleeki ɓurtuki (37°C), sibu waylo-waylo sec31-1 ina battina e golle komponent coat COPII Sec31 ngam haɗde COPII ɓuuɓde e yaltinde ER, karte kese sinteteeɗe ina moofta e ER (23). Caggal nde nguleeki mum tolnii e nguleeki (24°C), ƴiye muusɗe sec31-1 ɗee cellii e nokku ɗo ƴiye ɗee ngoni ɗoo, karte sintetik kese mooftaaɗe ɗee puɗɗii yaltineede e ER. Yiyngo CLIM hollitii wonde ko ɓuri heewde e Gas1-GFP e Mid2-iRFP keso sinndaaɗi ɗii ina moofti haa jooni e nder ER e nder geese muusɗe sec31-1 caggal nde ɗe njuppaa e 37°C, caggal ɗuum ɗe njaltinaa e 24°C fotde hojomaaji 5 (Natal 1). Nde tawnoo Mid2-iRFP ina renndini e nder ɓalndu ER fof, Gas1-GFP ina heewi, ina moofti e nokku ɓalndu ER mo jokkondiraani, renndinde ɗum en ina seerti no feewi (Natal 1, A haa C e Movie S1). Yanti heen, no hollir-ɗen e Natal 1D nii, fedde Gas1-GFP ndee alaa Mid2-iRFP. Ɗee geɗe kollitii wonde GPI-AP e poroteyiin transmembrane ina ceerti e nder nokkuuji membrane ER ceertuɗi ko adii. Koolol Gas1-GFP ngol ina ɓadii ERES keeriiɗo mo mCherry winndi e poroteyiin COPII coftal Sec13 (Natal 1, E e F, e filmo S1) (23).
Ɓowɗi sec31-1 ina kollita ɓuuɓri galaktose, ɓuuɓri asil juutndi (C26) seramiid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ɓaleejo) e poroteyiin gonɗo e nder ɓalndu Mid2-iRFP (TMP, bulo) e ooɗoo mbaydi ERES mahoowo Sec13-mES3 e hitaande 30 hojomaaji 5, diwtaa haa 24°C, SCLIM ƴetti natal mum hojomaaji 5 caggal ɗuum. (A haa C) hollirta ko natal 2D kawrital walla gootal wakiliijo e dingiral (A), natal 2D ƴellitaare 10 z-sections (B) walla natal 3D hemisphere cellal kargo e maandeeji ERES (C). Barme njuuteendi 1μm (A e B). Ko njuuteendi njuuteendi ndii woni 0,551μm (C). Gas1-GFP yiytaa ko e nokkuuji walla ɓulli ER ceertuɗi, Mid2-iRFP yiytaa, renndini ko e nder ɓalndu ER (C) fof. (D) Natal ina hollita tiiɗnaare ɓuuɓnde Gas1-GFP e Mid2-iRFP e nder ɓuuɓol Gas1-GFP e dow doggol ŋorol danewol (nano). AU, dental arbitraire. (E e F) ina kolla natal 3D ngal hawrata ko e marsandiis e maande ERES. Ko ɓuuɓri Gas1-GFP yiytaa ko sara ERES keeriiɗo oo. Ko njuuteendi njuuteendi ndii woni 0,551μm. (F) Ɓoggi daneeji tiiɗɗi ina maantiniri ɓuuɓri Gas1-GFP jokkondirndi e ERES. Paneele hakkundeeje e ñaamo ɗee ina kollita natal 3D mawngal kawraangal e yiyngo yirlotoongo e njuɓɓudi Gas1-GFP cuɓaandi ndii.
Jokkondiral nokkuwal ɓadtingal hakkunde fedde Gas1-GFP e ERES keeriiɗo ina hollita wonde Gas1-GFP ina waawi naatde e ERES cuɓaaɗo, ko ɗum seerti e cuɓagol ngol Mid2-iRFP huutortoo ngam yaltude ER. Ngam vurtinde ndee feere, min limtii limre ERES ndee e marsandiis gooto walla zizo tan (Natal 2, A haa C). En tawii ko ɓuri heewde e ERES (70%) ina njogii sifaa karte gooto tan. Natal les ngal Natal 2C hollitii yeruuji ɗiɗi tippudi ERES tawa ko Gas1-GFP tan (Natal 1) walla Mid2-iRFP tan (Natal 2). E nder ɗuum, ko ina wona 20% e ERES ina waɗi kaɓirɗe ɗiɗi gonɗe e nokku gooto. Tawaa won e ERES (10%) ina njogii sifaaji ɗiɗi karte, kono ɗe ceertii e nokkuuji ceertuɗi laaɓtuɗi. Ko ɗum waɗi, ndeeɗoo wiɗto limto hollitii wonde caggal nde ER yaltinaa, GPI-AP Gas1-GFP e karte transmembrane Mid2-iRFP ina peccii e ERES ceertuɗi (Natal 2D). Ndeeɗoo feere renndinde ina yahdi no feewi e ƴeewndo biokimikaaji ɓennuɗi ɗii (6) e anndinde morfolooji (7). Eɗen mbaawi kadi teskaade jikkuuji kaɓirɗe karantinaaɗe naatɗe e ERES (Natal 2E e Film S2). Natal 2E hollitii wonde ko feccere seeɗa tan e Gas1-GFP (panneel 3) walla Mid2-iRFP (panneel 4) naatata e ERES ummoraade e bannge gooto, ina fawii e nokku keeriiɗo. Panneel 5 e Natal 2E hollitii wonde Gas1-GFP e Mid2-iRFP ina tawee sahaa e sahaa fof e nder ERES gooto, kono ina naata e banngeeji ceertuɗi, ina kawra e nokkuuji ceertuɗi baawɗi lomtaade ɓuuɓri COPII ceertundi. En teskiima kadi wonde seerndude e renndinde GPI-AP Gas1 baɗaaɗo e seramiid C26 oo, ko ERES cuɓaaɗo, ko huunde teeŋtunde sabu karte goɗɗe gonɗe e nder ɓalndu, hono poroteyiin gonɗo e ɓalndu plasma biyeteeɗo Axl2 (27 ), holliroowo jikkuuji nannduɗi e Mid2-iRFP. (Natal S1 e Filmu S3). Axl2-GFP keso sinndaa oo ina renndini e nder ɓalndu ER hono Mid2-iRFP (Natal S1, A e B), ina wondi e Mid2-iRFP e nder ko ɓuri heewde e ERES (Natal S1, B haa D). Panneeji 1 e 2 e Natal 1. S1C ina hollita yeruuji ɗiɗi tippudi ERES ɗo karte ɗiɗi transmembrane njiylotoo. E nder ɗeen geɗe, marsandiisuuji ɗii fof ina naata e ERES gooto (Natal S1E, Panel 3 e Film S3).
Piɓaaji sec31-1 peeñninɗi ɓuuɓri galaktose, Gas1-GFP (GPI-AP, ɓaleejo) e Mid2-iRFP (TMP, bulo) e ERES gonɗo e ɓuuɓri Sec13-mCherry (ERES, magenta) mbaɗaa e 37 Caggal nde ɓuuɓri ndii ɓuuɓnaa e °C haa 30 minit block, e natal e SCLIM caggal hojomaaji 20. (A haa C) Nate 2D peeñɗe (A; barme njuuteendi, 1μm) walla nate 3D hemisfeer cellal (B e C; yuɓɓo njuuteendi, 0,456μm) karte ɗee e taƴe z 10 ɗe ERES maantini. Panneel les oo e nder (B) e panneel e nder (C) ina kollita nataluuji peewnaaɗi ngam hollirde tan ko geɗe tawaaɗe e ERES (boɗeejo) [Gas1-GFP (boɗeejo) e Mid2-iRFP (boɗeejo)]. (C) Ɓoggi udditiiɗi : ERES ina jogii tan ko jolngo wooto (1 haa 4). Ɓoggi ɓaleeji : ERES ina waɗi kaɓirɗe ceertuɗe (5). Ɓoggi ɓaleeji tiiɗɗi : ERES ina waɗi kaɓirɗe co-located. Les ɗoo : ERES gooto cuɓaaɗo oo ina waɗi tan Gaas1-GFP (1) walla Mid2-iRFP (2). Barme njuuteendi, 100 nm. (D) Ƴeewndo fotomikrogaraam sifotooɗo e (C). Hakindo teemedere ERES mo karte gooto tan (Gas1-GFP walla Mid2-iRFP), karte ceertuɗe e karte gonɗe e dow mum. E nder jarribooji tati keertiiɗi, n=432 e nder 54 cellal. Barre majjere = SD. Test t mo wutteeji ɗiɗi ɗi njiidaani. *** P = 0,0002. (E) Natal 3D ERES cuɓaaɗo e karte karantinaaɗe maande (C). Gaas1-GFP (haako-ñebbe) (3) walla Mid2-iRFP (bulo) (4) ina naata e ERES (haako-ñebbe) ummoraade bannge gooto, ina reerɗi e nokku tokooso nder ERES. Heen sahaaji, sifaaji kaɓirɗe ɗiɗi ɗee kala ina naata e ERES gooto (5) ummoraade e bannge gooto, ina kaɗee e nokku keeriiɗo e nder ERES. Barme njuuteendi, 100 nm.
Ko adii ɗuum, min ƴeewtindiima miijo wonde seramiid (C26) juutɗo mo caɗeele asil gonɗe e nder ɓalndu ER ina riiwta njuɓɓudi keeriindi e renndinde Gas1 e nder ERES cuɓaaɗo. E nder ɗuum, min kuutoriima mbaydi lewru wayliindi GhLag1, ɗo sintaaji ɗiɗi seramiid nder ɓalndu Lag1 e Lac1 lomtinaa e GhLag1 (homolog Lag1 mo koton), ɗum jibini mbaydi lewru jogiindi mbaydi cellal mbaydi Ceramide ɓurndi juutde e mbaydi ladde (Natal 3A) (2). Njiylawu spectrométrie masse (MS) hollitii wonde e nder mbaydiiji laddeeji, 95% e seraaji ɗii fof ko seraaji cakkitiiɗi juutɗi no feewi (C26), e nder GhLag1, 85% e seraaji ɗii ko juutɗi no feewi (C18 e C16). ), ko 2% tan e seramiid woni seramiid juutɗo no feewi (C26) caɗeele. Hay so tawii ko seramideeji C18 e C16 ngoni seramideeji ɓurɗi teeŋtude yiytaaɗi e nder membrane GhLag1 haa jooni, wiɗto MS hollitii kadi wonde ankere GPI Gas1-GFP holliraaɗo e nder mbaydi GhLag1 ina waɗi seramideeji C26, ko nanndi e lipiduuji laddeeji. Kalitee oo ko noon (Natal 3A) (26). Ko ɗum waɗi, ɗum firti ko enzim mbayliigu seramiid Cwh43 ina suɓoo no feewi seramiid C26, hono no hollir-ɗen e Natal 26 nii, ina ɓuri waawde naatde e ankere GPI ummoraade e seramiid C26 seeɗa e nder mbaydi GhLag1. S2 (29). Ɗum fof e wayde noon, ɓalndu GhLag1 ina waɗi tan ko seramiid C18-C16, tawi noon Gas1-GFP ina jogii seramiid C26 haa jooni. Ndeeɗoo hujja ina addana ndeeɗoo mbaydi kuutorgal moƴƴal ngam safrude teeŋti noon e caɗeele njuuteendi caɗeele asil seramide membrane e nder ER. Darnde hippotetik e kalaas e sortugol. Ndeen, min njanngii ko adii fof mbaawka C26 Gas1-GFP mooftude e nder ɓulli e nder GhLag1 e allele muusɗo sec31-1 mo nguleeki mum tolnii e mikroskoop ɓuuɓɗo, ɗo kaɓirgal juutngal (C18-C16) tan woodi e nder membrane ER Ceramide (Natal 3). En teskiima wonde e nder sec31-1, ko ɓuri heewde e Gas1-GFP ina moofti e nder ɓulli, tawi noon Gas1-GFP e nder sec31-1 GhLag1 mo juutɗo (C18-C16) juutɗo seramiid ER membrane ɓuri heewde ko mooftaaka e renndinde e nder E nder ɓulli ER fof. So en ƴettii yeru, nde tawnoo njuɓɓudi C26 tuugiindi e seramid ina jokkondiri no feewi e ERES keeriiɗo (Natal 1), min njuurnitii caggal ɗuum mbele ngool laawol ina waawi kadi jogaade golle mekanisme ER eksport poroteyiin. GPI-AP ina huutoroo mbaydi keeriindi COPII ngam yaltinde ER, ndi Ted1′s rewindata no feewi e mbayliigu mbaydi feccere glycan e ankere GPI (30, 31). Ndeen GPI-glikan mbayliigu nguu ina anndiree p24 jaɓɓotooɗo karte transmembrane, mo nganndu-ɗaa ina suɓoo Lst1, woni isoforme keeriiɗo e lowre COPII mawnde jokkondirnde e karte Sec24, waɗta ɗum e COPII Vesicles-33 keewɗo GPI-AP ina haani (33). Ko ɗum waɗi, min mbaɗii mbayliigu ɗiɗaɓuru kawruɗo e momtugol ɗeen poroteyiinuuji gooti (komponent p24 kuuɓtodinɗo Emp24, enzim mbayliigu GPI-glikan Ted1 e ɓuuɓri COPII keeriiɗo Lst1) e mbayliigu mbayliigu sec31-1, min njanngi ɗum Mbele ina waawi waɗde Gasster GFP1-clu3). En teskiima wonde e nder sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ɓuri heewde ko ɓuuɓde e renndinde e nder ɓalndu ER fof, hono no yiyraa e sec31-1 GhLag1 nii, tawi noon e sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP No sec3. Ɗee geɗe kollitii wonde, gaagaa woodgol seramide C26 e nder ɓalndu ER, mooftugol Gas1-GFP ina foti kadi jokkondirde e p24, tee alaa ko ɗaɓɓi e mum so wonaa ƴellitde Lst1 keeriiɗo. Ndeen, min ƴeewtindiima mbaawka njuuteendi ɓoggol seramiid e nder ɓalndu ER ina waawi reende jokkondiral Gas1-GFP e p24. Kono tan, en njiyii wonde woodgol seramiid C18-C16 e nder memtinaari ndii ina addana GPI-glikanuuji ɗi kompleks p24 feewni ɗii (Natal S3 e S4, A e B) walla jokkondirde e GPI-AP e yaltinde GPI-AP. aandal. Rewrude e COPII mbaydi Lst1 (Natal S4C). Ko ɗum waɗi, njuɓɓudi C26 fawii ko e seramide ɗaɓɓaani jokkondiral poroteyiin e laabi poroteyiin ER ceertuɗi, kono ina wallita e mbaadiiji ceertuɗi gonɗi e njuuteendi lipid. Ndeen, min ƴeewtindiima so tawii njuuteendi ɓoggol asil seramiid e nder membrane ER ina waɗi nafoore ngam senngo Gas1-GFP no moƴƴi e ERES cuɓaaɗo. Nde tawnoo Gas1 e nder mbaydi GhLag1 jogiindi seramide cakkital juutngal ina yalta ER ina naata e nder ɓalndu plasma (Natal S5), eɗen cikki so sortugol ngol ina diwa e njuuteendi cakkital asil seramiid, Gas1 e nder mbaydi GhLag1 ina waawi rewrude e taƴde. Marsandiis ERES mo memmbaan gooto.
(A) Membraan cellal GhLag1 ɓuri heewde ko seramiideeji C18-C16 ɓurɗi juutde, tawi noon ankere GPI Gas1-GFP ina jogii haa jooni C26 IPC hono cellal ladde. Dow : ƴeewndo njuuteendi caɗeele asil seramiid e nder ɓalndu cellal mbaydiiji ladde (Wt) e GhLag1p e mbaydi spektorometri masse (MS). Dowlaaji ɗii ina kollita teemedere e nder teemedere (100) seramide fof. Hakindo jarribooji tati keertiiɗi. Barre majjere = SD. Test t mo wutteeji ɗiɗi ɗi njiidaani. **** P <0,0001. Panneel les : ƴeewndo MS njuuteendi caɗeele asil IPC tawaaɗe e ankere GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) holliraaɗo e nder mbaydiiji ladde e GhLag1p. Dowlaaji ɗii ko teemedere e nder teemedere (100%) e signal IPC fof. Hakindo jarribooji joy keertiiɗi. Barre majjere = SD. Test t mo wutteeji ɗiɗi ɗi njiidaani. ns, alaa ko nafata. P = 0,9134. (B) Mikrogaraamuuji ɓuuɓɗi gonɗi e ƴiye gonɗe e ƴiye gonɗe e ƴiye gonɗe e ƴiye gonɗe e ƴiye gonɗe e ƴiye gonɗe e ƴiye gonɗe e ɓuuɓri gonɗe e dow 37°C ngam 37°C fotde 37°C caggal 24°C. Ɓoggi daneeji : ER Gas1-GFP. Ɓoggi udditiiɗi : Gas1-GFP mo ɓuuɓnaaka ina renndini e nder ɓalndu ER fof, ina hollita mbaydi ER mbaydi cirƴam nukliyeer. Barme njuuteendi, 5μm. (C) Ƴeewndo fotomikrogaraam sifotooɗo e (B). Hakindo teemedere e nder teemedere (100) ƴiiƴam jogiiɗam mbaydi punndi Gas1-GFP. E nder jarribooji tati keertiiɗi, n≥300 ƴiiƴam. Barre majjere = SD. Test t mo wutteeji ɗiɗi ɗi njiidaani. **** P <0,0001.
Ngam safrude ndee caɗeele no feewi, min mbaɗii ƴeewndo SCLIM wonande Gas1-GFP e Mid2-iRFP e nder GhLag1 e allele muusɗo sec31-1 (Natal 4 e Filmu S4). Caggal nde ER oo jogaa e 37°C, caggal ɗuum yaltinaa e 24°C, ko ɓuri heewde e Gas1-GFP keso oo, mooftaaka, renndinaaka e nder ɓalndu ER oo fof, hono no yiyraa e mikroskoopuuji gaadoraaɗi ɗii nii (Natal 4, A e B ). Yanti heen, teemedere mawnde e ERES (67 %) ina waɗi sifaaji ɗiɗi karte co-located e nder mum (Natal 4D). Panneeji 1 e 2 Natal 4C ina kollita yeruuji ɗiɗi tippudi ERES tawa ina njogii Gas1-GFP e Mid2-GFP gonɗi e dow mum en. Yanti heen, marsandiisuuji zi fof vursaama e nder ERES gooto (Natal 4E, panel 3 e filmo S4). Ko ɗum waɗi, njeñtudi men ina hollita wonde njuuteendi ɓoggol asil seramiid e nder ɓalndu ER ko huunde himmunde e mooftude e renndinde poroteyiin ER.
Sec31-1 Piɓaaji GhLag1 peeñninɗi ɓuuɓri galaktose, Gas1-GFP (GPI-AP, ɓaleejo) e Mid2-iRFP (TMP, daneejo) e Sec13-mCherry (ERES, ɓaleejo) gonɗo e ERES (ERES, ɓaleejo) ina ɓuuɓna e nguleeki 37°C. Jokkude fotde hojomaaji 30, ɓuuɓna haa 24°C ngam yaltinde ƴiiƴam, natal e SCLIM caggal hojomaaji 20. (A haa C) Nate 2D peeñɗe (A; barme njuuteendi, 1μm) walla nate 3D hemisfeer cellal (B e C; yuɓɓo njuuteendi, 0,45μm) e taƴe 10 z ɗe kargo e ERES maantini. Panneel les oo e nder (B) e panneel e nder (C) ina kollita nataluuji peewnaaɗi ngam hollirde tan ko geɗe tawaaɗe e ERES (boɗeejo) [Gas1-GFP (boɗeejo) e Mid2-iRFP (boɗeejo)]. (C) Ɓoorno-ɗaa wutte daneejo : ERES, marsandiis ina ɓuuɓtoo. Uddit : ERES ina waɗi huunde wootere tan. Panneel les : ERES cuɓaaɗo oo ina jogii marsandiisuuji gonɗi e dow mum (1 e 2) maandeeji e (C). Barme njuuteendi, 100 nm. (D) Ƴeewndo fotomikrogaraam sifotooɗo e (C). E nder yuɓɓooji sec31-1 e sec31-1 GhLag1, ko karte gooto tan (Gas1-GFP walla Mid2-iRFP) naati heen, e teemedere ERES wonande karte ceertuɗe e karte gonɗe e dow mum. E nder jarribooji tati keertiiɗi, n = 432 e nder 54 ƴiiƴam (sec31-1) e n = 430 e nder 47 ƴiiƴam (sec31-1 GhLag1). Barre majjere = SD. Test t mo wutteeji ɗiɗi ɗi njiidaani. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Natal 3D ERES cuɓaaɗo e karte (3) gonɗe e dow mum (C). Gas1-GFP (haako-ñebbe) e Mid2-iRFP (bulo) ina ɓadtoo ERES (haako-ñebbe) ummoraade e bannge gooto, ina ngondi e nokku gooto mo ERES keertini. Barme njuuteendi, 100 nm.
Ndeeɗoo wiɗto ina rokka seedeeji laaɓtuɗi e nder nguurndam (in vivo) wonde karte poroteyiin baɗaaɗe e lipid ina ceerti e nokkuuji cuɓaaɗi e nder laawol gonngol e nder ɓalndu, ina hollita kadi nafoore njuuteendi caɗeele asil ngam suɓaade peccitagol. Huutoraade karallaagal mikroskopi doolewal e taƴngal, biyeteengal SCLIM, min kollitii Gas1-GFP (membran plasma mawɗo GPI-AP mo feccere lipid ceramide asil (C26) juutnde no feewi) sintetik keso oo e nder lewru ) Nokkuuji mooftaaɗi e nder ERs keeriiɗo ceertuɗi, ina njokkondiri e ERs keeriiɗo transmbrame, ina njokkondiri e ERs keeriiɗo ceertuɗo ko ɓuuɓri ER (Natal 1). Yanti heen, ziin sifaaji zizo marsandiis ina naata e ERES ceertuzi e suvagol (Natal 2). Njuuteeki cakkital asil seramiid cellal e nder memmbaan ina ustoo gila e C26 haa C18-C16, ɓuuɓri Gas1-GFP ina ustoo e nder diiwaan ER ceertuɗo oo, Gas1-GFP ina wayla laawol ngam yaltude ER e poroteyiin transmembrane rewrude e ERES gooto (Natal 3 e Natal3). 4).
Hay so tawii GPI-AP ina huutoroo feere poroteyiin keeriiɗo ngam yaltude ER, en njiyii wonde seerndude C26 fawaade e seramide tuugnaaki e jokkondire poroteyiin ceertuɗe baawɗe addande ERES keeriiɗo (Natal S4 e S5). E nder ɗuum, ko min tawi koo ina wallita e feere senngo woɗnde, nde njuɓɓudi poroteyiin tuugiindi e lipiduuji e caggal ɗuum ittude karte goɗɗe. Teskagol men ina hollita wonde diiwaan Gas1-GFP walla njuuteendi jokkondirndi e ERES keeriiɗo ina ŋakki e poroteyiin Mid2-iRFP gonɗo e nder ɓalndu, ko ɗum hollirta wonde njuuteendi GPI-AP fawii ko e seramiid C26 maa wallit naatgol mum en e nder ERES jowitiingal e ɗuum, e oon sahaa kadi, ina itta heen ɓuuɓri keeriindi TheFigESu 2). E ko feewti heen, woodgol seramideeji C18-C16 e nder ɓalndu ER addantaa GPI-AP waɗde diiwanuuji walla ɓuuɓri, ɗum noon ɗi ndartinaani walla lomtinaani poroteyiinuuji gonɗi e nder ɓalndu e nder ERES gooto (Natal 3 e 4). . Ko ɗum waɗi, eɗen mbiya wonde seramiid C26 ina addana seerndude e renndinde, tawa ina newna mooftude poroteyiinuuji jokkondirɗi e ERES keeriiɗo.
Hol no keɓirten ndeeɗoo jokkere enɗam fawaade e seramide C26 e nder nokku ER keeriiɗo ? Teskagol seramiid membrane seertude e banngeeji ina waawi addande seramiid GPI-AP e C26 waɗde lipiduuji tokoosi, njuɓɓudi e nder sahaa gooto e nder nokku lipiduuji ɓurɗi yuumtude e membrane ER jogiiɗo gliserolipideeji ɓurɗi juutde e ɗi ngalaa ɓuuɓri. Koolol kalite (17, 18). Ɗeeɗoo ɓuuɓɗe tokoose joopaaɗe ina mbaawi ɓeydaade jokkondirde e ɓuuɓɗe ɓurɗe mawnude, ɓurɗe tiiɗde caggal nde ɗe njokkondiri e p24 (34). E tuugnaade e ɗuum, min kollitii wonde C26 Gas1-GFP ina foti jokkondirde e p24 ngam waɗde ɓuuɓri yiyteende ɓurndi mawnude (Natal 3). Koolaaɗo kuuɓal p24 ko oligomer heterozigot, baɗɗo poroteyiinuuji nay ceertuɗi p24 transmembrane e nder lewru (35), ko ɗum addanta jokkondire keewɗe, baawɗe addande jokkondire hakkunde ɓuuɓri GPI-AP tokosiri, ɗum noon ina addana ɓuuɓri Stable ɓurndi mawnude (34). Jokkondiral hakkunde ektodomenuuji poroteyiin GPI-AP ina waawi kadi wallitde e mooɓondiral mum en, hono no hollirtee e nder yah-ngartaa mum en Golgi e nder geese epiteliyal polarize mammal (36). Kono so seramiid C18-C16 ina woodi e nder ɓalndu ER, so p24 ina jokkondiri e Gas1-GFP, ɓuuɓri mawndi ceertundi waɗataa. Laawol les ngol ina waawi fawaade e sifaaji keertiiɗi fisik e kemikal seramiid juutɗo asil. Wiɗtooji biyofizik e membraneeji artifisiyel ina kollita wonde hay so tawii seramideeji juutɗi (C24) e juutɗi (C18-C16) ina mbaawi saabaade seerndude fasaaji, ko seramideeji juutɗi (C24) tan mbaawi wallitde Curvature toowɗo e ɓuuɓgol filmo ngam waylude mbaadi filmo oo. Rewrude e jokkondire (17, 37, 38). Kollit-ɗen wonde helmere transmembrane TMED2, homologue neɗɗo Emp24, ina jokkondiri e sfingomiyelin baɗɗo seramiid C18 e nder ɓuuɓri sitoplasma (39). E kuutoragol simulaaji dinamiik molekulaaji (MD), en njiyii wonde seramideeji C18 e C26 fof ina moofta e saraaji ɓuuɓri sitoplasmaaji helix transmembrane Emp24, tee ina njogii ɓure nannduɗe (Natal S6). Ina teskaa wonde ɗum ina hollita wonde helmere transmembrane Emp24 ina waawi addude peccitagol asimetrik lipiduuji e nder membrane. Ɗumɗoo ko njeñtudi kesiri tuugiindi e ƴiye mammal. Simulaaji MD nannduɗi e ɗii ina kollita kadi woodde lipiduuji eteer (40) . Ko ɗum waɗi eɗen cikki wonde seramiid C26 e nder lobule ɗiɗi ER26 ina alɗi e nokku. So GPI-AP e nder lobule luminal ina jokkondiri no feewi e p24 multivalent e mooftude seramide C26 e nder p24 e nder lobule sitoplasma, ina waawi wallitde jokkondire Protein aggregation e ɓuuɓri membrane ina peeña e koppi (41), addana GPI-AP kadi seertude e nokku toowɗo adES diiwanuuji gonɗi e nder ɓalndu ER (42). Ciimtol ɓennungol ngol ina wallita e feere ƴettaande ndee (43, 44). Jokkondire keewɗe hakkunde oligolektinuuji, pathogen walla antibiotik e glikosfingolipideeji (GSL) baɗɗi seramiid e dow ɓalndu plasma ina addana GSL mooftude no feewi, ina ɓeyda seerndude fasaaji, ina addana ɓalndu nduu waylude e nder ɓalndu (44). Iwabuchi ekn.
E nder ƴiye epiteliije polarizeeje mammal, ɓuuɓri resooji anti-Golgi (TGN) haa to tolno ɓuuɓri plasma apikal ina jogoo seerndude e renndinde GPI-AP (10, 45). Ndeeɗoo mooɓondiral ina doga e oligomerisaasiyoŋ GPI-AP (36), kono ina waawi kadi fawaade e njuuteendi caɗeele seramide ɗe njiy-ɗen e lewru. Hay so tawii GPI-AP mammal ina jogii ankere tuugiiɗo e lipiduuji eter, e sifaa mum kemikal ina seerti no feewi e seramide cakkitiiɗo asil juutɗo no feewi, wiɗto sakkitiingo hollitii wonde lipiduuji ɗii fof ina njogii sifaaji fisik e kemikal nannduɗi e ƴellitaare E golle (40). Ko ɗum waɗi, feccere lipid eteer e nder geese mammal ina waawi nanndude e seramiid C26 e nder lewru, tee darnde mum ko jokkondirde e seramiid gonɗo e caɗeele juutɗe e nder memtinaari ngam wallitde mooftude e renndinde GPI-AP. Hay so tawii noon ndeeɗoo feere ina foti ƴeewteede haa jooni no feewi, ko yiytaa ko adii ɗuum ina hollita wonde nawde seramiid juutɗo mo caɗeele asil ɗee mbaɗata e ɓanndu Golgi, waɗaaka e poroteyiinuuji baylotooɗi sitoplasma, kono ina fawii e sintesis ankereeji GPI hono lewru. Ko ɗum waɗi, feere gonnde e ƴellitaare ndee ina wayi no ina waawi suɓaade ko jokkondira e seramiid asil cakkitiiɗo juutɗo no feewi e GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) e nder ɓuuɓri jokkondire gooto.
E nder mbaydiiji ƴiiƴam epiteliyal polarizeeji lewru e mammal, mooftugol GPI-AP e seertude e poroteyiinuuji goɗɗi gonɗi e nder ɓalndu, fof ina waɗa hade mum yettaade dow ƴiiƴam. Paladino e woɗɓe. (48) tawi ko e dow TGN ƴiye epiteliije polarizeeje mammal, mooftugol GPI-AP wonaa tan ko ina haani ngam suɓaade mooftugol GPI-APs e membrane plasma apikal, kono kadi ina rewindaa yuɓɓo mooftugol GPI-APs e golle mum biyoloji. Daande cellal. E nder lewru, ndeeɗoo wiɗto hollitii wonde ɓuuɓri GPI-AP fawii ko e seramide C26 e dow ER ina waawi yuɓɓinde yuɓɓo ɓuuɓri e golle gollorɗe GPI-AP e dow ɓuuɓri plasma (24, 49). E tuugnaade e ngool laawol, ƴiye GhLag1 ina mbaawi alerji e reennooɓe GPI walla leɗɗe baawɗe bonnude timmugol ƴiye (28), e ŋakkeende njuɓɓudi Gas1-GFP gollorndi (49) e tip ceramide peeñninaaɗo e nder jokkondire ƴiye lewru ina hollita G Batte fisik baawɗe wonde e ƴiye hLag1. Juumre GPI-AP. Kono tan, ƴeewndo ngoɗngo mbele yuɓɓo gollorngo ɓalndu nduu ina porogaraam gila e ER e feere renndinde tuugiinde e njuuteendi lipid, maa won ko njiylotoɗen e wiɗtooji men garooji ɗii.
Soklaaji Saccharomyces cerevisiae kuutorteeɗi e ndeeɗoo golle ina limtaa e alluwal S1. Ko MMY1583 e MMY1635 mbaydiiji SCLIM ngam ƴeewde cellal nguurndam peewniraa ko caggal W303. Ɗeeɗoo mbaydiiji peeñninɗi Sec13-mCherry jogiiɗi tagaaɗo poroteyiin ɓuuɓɗo, peewniraa ko feere tuugornde e mbaydi polimeraas (PCR) tawa ina waɗi pilaasmid pFA6a ko wayi no mbaydi (23). Soklaaji baylotooɗi Mid2-iRFP gonɗi e poroteyiin ɓuuɓɗo e les njiimaandi ƴellitoowo GAL1 ɗii, peewniraa ko nii. PCR ɓeydugol jokkondire iRFP-KanMx ummoraade e mbaydi pKTiRFP-KAN (dokkal E. O’Shea, limoore pilaasmid Addgene 64687; Caggal nde mbaydi genooji Mid2-iRFP ɓeydaa, taƴaa e nder ƴellitoowo GAL1, ɗum naatnaa e nokku Not I-Sac I mo pilasmid pRS306 jokkondirɗo oo. Pilasmid pRGS7 keɓaaɗo oo, liggortee ko e Pst I ngam naatde e nokku URA3.
Taƴre fusiyoŋ Gas1-GFP ina feeñnina e les njiimaandi ƴellitoowo GAL1 e nder pilaasmid sentromere (CEN), mo peewnirtee ko nii. Koolondiral Gas1-GFP ɓeydaama e PCR ummoraade e pilaasmid pRS416-GFP (24) (dokkal L. Popolo) e taƴde e nder nokku Xma I–Xho I pilaasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (dokkal C) . Miler; Limoore pilaasmid addi ko 51225; Ko ɗoon woni 51225; RRID: Ɓeydagol_51225). Pilasmid keɓaaɗo oo innitiraa ko pRGS6. Taƴre fusiyoŋ Axl2-GFP ndee kadi ina feeñnina e les njiimaandi ƴellitoowo GAL1 mo pBEVY-GL LEU2, e mahngo mum ko nii. Koolondiral Axl2-GFP ngal ɓeydaama e pilasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) e PCR, ngal taƴaa e nokku Bam HI-Pst I mo pBEVY-GL LEU2 gonɗo e mum oo. Pilasmid keɓaaɗo oo innitiraa ko pRGS12. Koolondiral oligonukleotideeji kuutorteeɗi e ndeeɗoo wiɗto ina winndaa e alluwal S2.
Sokla oo ɓeydaama e 0,2% adenin e 2% glukos [YP-dekstroos (YPD)], 2% rafinoos [YP-rafinoos] keewɗo ƴiiƴam ƴiiƴam p (YP) hakkundeejo (1 % ƴiiƴam ƴiiƴam e 2% poroteyiin ept). (YPR)] walla 2% galaktose [YP-galaktose (YPG)] ko ɓuuɓri karbon, walla e nder weeyo sintetik tokooso (0,15% base azot lewru e 0,5% sulfaat amoniyum) ngam ɓeydude asideeji amin e baseeji potɗi hatojineede ngam ñamri , E ina waɗi 2% sintetik glukose2 seeɗa ( (galaktose sintetik ɓurɗo famɗude) ko ƴulɓe karbon.
Ngam ƴeewde e sahaa goonga, ƴiye sec31-1 baylotooɗe nguleeki, peeñninɗe konngol ngol e les njiimaandi GAL1, mawninaama e nder weeyo YPR to 24°C jamma haa faɗo hakkundeejo. Caggal nde ƴiiƴam ɗam naati e YPG e nguleeki 24°C fotde waktu gooto, ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaa e SG e nguleeki 37°C fotde hojomaaji 30, caggal ɗuum ɗam waɗtaa e 24°C ngam yaltude e bolol gonngol e ɓuuɓri ndii. Concanavalin A huutoraa ko ngam fiɓde ƴiye ɗee e dow laylaytol gilaas, SCLIM ƴetti ɗum. SCLIM ko jillondiral hakkunde mikroskoop ɓuuɓɗo Olympus IX-71 e UPlanSApo' 100×1.4 lens nebam ɓuuɓɗo limoore (Olympus), njaaweeki mawki e toowki njuuteendi signal-e-noddaango gonɗo e yirlaade (Yokogawa Electric e mbaydi kuutorgal), ƴulɓe ƴulɓe (Yokogawa Electric e ƴulɓe kuutorteeɗe). (Fotonik Hamamatsu) ina waawi rokkude mbaydi lens mawningol mawningol timmungol ×266,7 e kamera kaɓirgal jokkondirngal e njamndi, keewngal elektoronik (Fotonik Hamamatsu) (21). Keɓgol natal ngal ko lowre keertinnde (Yokogawa Electric) waɗata ɗum. Ngam natal 3D, min kuutoriima ƴulɓe (actuator) piezoelektrik baɗaaɗo e dow yamiroore ngam diwtude lenyol ngol e dow ŋorol, min moofti geɗe optik ɗee 100 nm e nder laylaytol. Natal Z-stack ngal wayletee ko e doggi voxel 3D, e gollal saaktude toɓɓe teori kuutorteeɗe ngam mikroskoop konfokaal diski yirlotooɗo oo huutortee ngam ƴellitde dekonvolusiyoŋ e lowre Volocity (PerkinElmer). E huutoraade lowre Volocity ngam ustude otooji ngam yuurnitaade nokkuuji co-location, ERES ina heen kargo ina fotnoo. Anndugol ƴeewndo laabi waɗiraa ko e lowre MetaMorph (Kaɓirɗe Molekulaar).
Huutoro lowre GraphPad Prism ngam anndude nafoore limto. Wonande t-test Student mo wutteeji ɗiɗi e jarribo ordinateer gooto (ANOVA) gonɗo e laawol gootol, ceertugol hakkunde pelle ina hiisee ina jogii batte keewɗe e P <0.05 (*).
Ngam mikroskoop fluoresans Gas1-GFP, ƴiye faɗo log ɗee mawninaama jamma e nder YPD, mooftaa e senngo, loowaa laabi ɗiɗi e saline tampon fosfaat, ɓuuɓnaa e dow ice ko famɗi fof hojomaaji 15, caggal ɗuum njahra e les mikroskoop no siforaa adan nii (Check24). Mikroskoop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 nebam PH3 CS) jogiiɗo ƴulɓe, filtirde L5 (GFP), kamera Hamamatsu e lowre Application Suite X (LAS X) kuutoraa ngam heɓde ɗum. .
Sammbaaji ɗii njuurnitaama e tampon sammbaaji SDS to 65°C fotde hojomaaji 10, caggal ɗuum ceertuɗi e elektoroforesis gel SDS-poliakrilamid (PAGE). Ngam ƴeewndaade immunoblotting, 10 μl eɓɓoore ndee ina loowee e laana kala. Antibiotik gadano : Huutoroo anti-Gas1 poliklonaal mbaroodi e ɓuuɓri 1:3000, anti-Emp24 poliklonaal mbaroodi e ɓuuɓri 1:500, e anti-GFP poliklonaal mbaroodi (dokkal H. Riezman) e ɓuuɓri 1:3000. Ko ɓuuɓri monoklonaal gonndi e Pgk1 huutoraa e ɓuuɓri 1:5000 (dokkal J. de la Cruz). Antibiotik ɗiɗaɓo : Peroksidaas (HRP) gonɗo e ngaari gonɗo e mboros oo, kuutorteeɗo e ɓuuɓri 1:3000 (Pierce). IgG ngaari gonndi e HRP huutoraama e ɓuuɓri 1:3000 (Pierce). Zone jaabawol immunisans yiytaa ko e feere kemiluminesans (kimiluminesans) e mbaydi ''SuperSignal West Pico'' (Thermo Fisher Scientific).
No siforaa e (31) nii, jarribo immunoprecipitation naturel waɗaama e feccere ER alɗunde ndee. E raɓɓiɗinaade, lootde ƴiye lewru e tampon TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fenilmetilsulfonil fluoriid 1 mM e ɓuuɓri ɓuuɓndi ɓuuɓri) e 600 nm ( OD600) e 100 optik. Nde taƴaa ko e ɓuuɓri gilaasi, caggal ɗuum ɓuuɓri cellal e ɓuuɓri gilaasi ndii ittaa e senndifugaasiyoŋ. Ndeen ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaama e 17 000 g fotde hojomaaji 15 e nguleeki 4°C. Pellet oo rewnaa e TNE, saponin digitalis ɓeydaa heen haa 1% e njuuteendi mum timmundi. Suspension oo ina ɓuuɓna fotde waktu 1 e yirlaade to 4°C, caggal ɗuum geɗe ɗe ɓuuɓnataa ɗee njaltinaa e senngo 13 000 g to 4°C fotde hojomaaji 60. Ngam ƴellitde ƴiiƴam Gas1-GFP, ko adii fof, ko adii fof ko ɓuuɓnude ƴiiƴam ɗam e ɓuuɓri agarose (ChromoTek) e nguleeki 4°C fotde waktu gooto, caggal ɗuum ɓuuɓna ɗum e GFP-Trap_A (ChromoTek) e nguleeki 4°C fotde waktuuji 3. Beeli immunopresipitaaji ɗii loowaama laabi joy e TNE ina waɗi 0,2% digoksigenin, ɓuuɓnaa e tampon sample SDS, seerndaa e SDS-PAGE, ƴeewndaa e immunoblotting.
No siforaa e (31) nii, anndinde jokkondire hakkunde-leyɗe waɗaama e feccere ER alɗunde ndee. E tonngol, feccere ER alɗunde ndee, ɓuuɓnaama e 0,5 mM ditiyobis (propiyonat suksinimidiil) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Amerik; 20°C, 20 min). Ko ɓuuɓri gonndi e ɓuuɓri ndii ɓuuɓnaa e ɓeydugol glisin (50 mM ɓuuɓri timmundi, hojomaaji 5, 20°C).
No siforaa adan nii (50), ƴeewndo MS e ceramide e nder mbaydiiji ladde e GhLag1 waɗii. E raɓɓiɗinaade, ƴiiƴam ɗam mawni haa faɗo esponensiyal (3 haa 4 OD600 unit/ml) e nder YPD e 30°C, ƴiiƴam 25×107 ƴettaa. Ko mbayliigu majji ɓuuɓnata e asid trikloroasetik. Huutoroo ɓuuɓri ƴettugol [etanol, ndiyam, eteer, piridin e 4,2 N hidroksiid amoniyum (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol e kalite seramiid C17 gonɗo e nder mum (860517, lipid polaar Avanti). Huutoroo ƴulɓe monometilamin [metanol, ndiyam, n-butanol e ɓuuɓri metilamin (4:3:1:5 v/v)] ngam waɗde hidrolisis alkali ɓuuɓɗo e ɓuuɓri ndii, caggal ɗuum huutoroo n-butanol keewɗo ndiyam ngam ustude lamɗam. E joofnirde, ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaama e nder ɓuuɓri mbaadi moƴƴiri [kuloroform/metanol/ndiyam (2:7:1) + asetaat amoniyum 5 mM], ɗam waɗtaa e nder ƴulɓe masse. Monitorgol keewngol (MRM) waɗiraa ko ngam anndude e limtude molekule sfingolipid. Ɗemngal TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ina waɗi roboo biyeteeɗo Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ngam yuurnitaade ƴiiƴam. Semmbe colli ina moƴƴi e kala cate ceramide. Dataaji MS keɓaama e mbaadi moƴƴiri. Kala rewtinnde biyoloji, maande lipid ko hakkundeere fotdeeji tati keertiiɗi.
No siforaa e (31) nii, ƴiye (800×107) peeñninɗe Gas1-GFP ɗee, mbaɗtaa ko e mbaydi mbaylaandi. Gas1-GFP laaɓtuɗo oo seerndaa e SDS-PAGE, waɗtaa e ɓuuɓri poliviniliden (PVDF). Poroteyin oo yiytaa ko e mbaydi PVDF e ɓaleejo amide. Bannge Gas1-GFP taƴaa ko e PVDF, loowaa laabi 5 e metaan, laawol gootol e ndiyam ɓuuɓɗam (LC-MS). E nder ɓuuɓri ɓuuɓri ndii e 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampon e 500 μl ɓuuɓri kesiri ndi 1 M nitrite sodium ɓuuɓnaa e 37°C fotde waktuuji 3, feccere lipid ndee yaltata ko e Gas1-GFP e inofasin gluse hakkunde yaltinnde inofaamin (51). Caggal ɗuum, strip membrane oo loowaa laabi nay e ndiyam LC-MS, yoora e nguleeki suudu, mooftaa e weeyo azot to -80°C haa nde ƴeewndaa. Ko wayi no ƴeewndo, ko ƴeewndo blank membrane PVDF huutoraa e kala jarribo. Ndeen lipid mo Gas1-GFP ƴetti oo, MS ƴeewti ɗum no siforaa nii (50). E raɓɓiɗinaade, ƴiye PVDF baɗɗe GPI-lipid ɗee njuppaama e nder 75μl ɓuuɓri moolanaandi [kuloroform/metanol (1:2) + 5 mM asetaat amoniyum], njaltii e iyonizaasiyoŋ elektoro-spray (ESI)-MRM/MS Analyse e sifaaji sfingolipid (TSQ Vantage). E nder ɗuum, dokke MS keɓaama e mbaadi iyon negatif.
No mbiynoɗen nii, feccere lipid ankere GPI ndee seerti e GPI-AP mo [3H]-inositol (16) jogii. Lipiduuji ɗii ceerti ko e mbaydi ɓuuɓndi, kuutortoondi mbaydi ɓuuɓndi (55:45:10 kuloroform-metanol-0,25% KCl) e yiyteede e kuutoragol FLA-7000 (Fujifilm).
Piɓaaji baylotooɗi Gas1-GFP (600×107) ɗii loowaama laabi ɗiɗi e tampon TNE e tampon TNE, ɗi njuppaa e ɓuuɓri gilaas, caggal ɗuum ɗi njuumta ngam ittude ɓuuɓri piɓaaji e ɓuuɓri gilaas. Ndeen ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaama e 17 000 g fotde waktu 1 e nguleeki 4°C. Pellet oo loowaa e TNE, ɓuuɓnaa e 1 U PI-PLC (Invitrogen) e nder TNE ina waɗi 0,2% saponin dijital fotde waktu gooto e nguleeki 37°C. Caggal nde enzim oo safraa, membrane oo ittaa e 17 000 g e 4°C fotde waktu gooto. Ngam ustude Gas1-GFP, ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaama e GFP-Trap_A (ChromoTek) e nguleeki 4°C jamma. Gas1-GFP laaɓtuɗo mo SDS-PAGE seerndi oo, ɓuuɓnaama e ɓuuɓri Coomassie ɓuuɓndi. Bannge mbaylaandi Gas1-GFP taƴaa ko e gray taariindi ndiyam ɗam, caggal ɗuum caggal alkilaasiyoŋ e yodoasetamid e ustaare e dithiotreitol, diƴƴe nder gel e tripsin mbaɗaa. Ittugol e yoorde peptideeji triptik e peptideeji baɗɗi GPI-glikan. Peptiid yoorɗo oo ɓuuɓnaama e 20 μl ndiyam. Inniree feccere (8μl) e nder LC. Kolonel oktadesilsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; njaajeendi nder mum ko 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, diiwaan Aichi, Japon) huutoraa ngam seerndude peptideeji e nder ngonkaaji keertiiɗi mbayliigu. Faandaare mooftunde ndee ko solde A (0,08% asid formik) e solde B (0,15% asid formik e nder 80% asetonitril). Siistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) huutoraama ngam ustude koloñaal oo e ɓuuɓri A e nder hojomaaji 55 e ɓuuɓri 50 μl min-1 fotde hojomaaji 5, caggal ɗuum ɓuuɓri ɓuuɓri B ɓeydaa haa 40%. , leyɗeele dentuɗe Amerik). Eluat oo ina jokki e naatde e ɓuuɓri iyon ESI, e peptiideeji triptik e peptiideeji jogiiɗi GPI-glikanuuji ɗii, ƴeewtaama e LTQ Orbitrap XL (spektoromeeter masse iyon lineer hibriid; Thermo Fisher Scientific). E nder njuɓɓudi MS, doolnugol ɓuuɓol kapilaar ngol waɗaama e 4,5 kV, nguleeki kapilaar gonɗo e jolngo ngoo ina jogaa e 300°C. Voltage kapilaar e voltage lenyol tuubaako mbaɗtaa ko 15 V e 50 V. Dowlaaji MS keɓaama e mbaadi iyon moƴƴo (resolution 60 000; laaɓal masse 10 pecce e nder miliyoŋ) e nder njuuteendi masse 300/m/z masse/charge ratio (m/z) 3000. Dowlaaji MS/MS keɓaama e mbaydi iyon trap e nder XLsrap adannde e [Ors3]. jokkere enɗam (CID)].
Simulaaji MD mbaɗaama e kuutoragol lowre GROMACS (52) e fannu doole MARTINI 2 (53-55). Ndeen mahoowo membrane CHARMM GUI (56, 57) huutoraama ngam mahde bilayer ina waɗi diyoleoilfosfatidilkolin (DOPC) e Cer C18 walla DOPC e Cer C26. Topologie e coordinateeji Cer C26 ummorii ko e DXCE e ittude ɓuuɓri ɓeydaandi e wutte sfingosin. Huutoro feere sifotoonde les ndee ngam ballondiral e laral ɗiɗmal ngal e dogginde ngal, caggal ɗuum huutoro coordinateeji cakkitiiɗi ɗii ngam mahde njuɓɓudi ndi Emp24 woni e mum ndii. Domen transmembrane lewru Emp24 (heddiiɓe e 173 haa 193) feewnaa ko e α-helix kuutortooɗo mbaydi molekul kuutorgal MD (VMD) yiyteende (58). Ndeen, caggal nde lipiduuji gonɗi e dow mum ɗii ittaa, poroteyiin oo ɓuuɓnaama no feewi, waɗtaa e nder bilayer oo e kuutoragol CHARMM GUI. Siistem cakkitiiɗo oo ina waɗi 1202 DOPC e 302 Cer C26 walla 1197 DOPC e 295 Cer C18 e Emp24. Iyonize system o haa 0.150M. Koppiiji nay keertiiɗi mbaɗaa ngam jillondirde bilayer ɗiɗi.
Bilayer lipid oo ina balansee e kuutoragol peeje CHARMM GUI, ko ɗum woni ustude caggal ɗuum balanseede 405 000 ɗaɗol, ɗo ŋakkeende darnde ustata seeɗa seeɗa e ittude, ɗaɗol waktu ngol ɓeydee gila 0,005 ps haa 0,02 ps. Caggal nde nde ƴettaa, nde yaltina 6 μs e njuuteendi waktu 0,02 ps. Caggal nde naatnu-ɗaa Emp24, huutoroo ngool laawol CHARMM GUI ngam ustude e ballondiral e njuɓɓudi ndii, caggal ɗuum doga fotde 8 s e peewnugol.
Wonande denndaangal njuɓɓudiiji, e nder golle balans, ko barostaat Berendsen (59) jogori ƴellitde nguleeki kii, e nder golle peewnugol, ko barostaat Parrinello-Rahman (60) jogori jogaade doole. E nder ɗeeɗoo geɗe kala, tolno nguleeki ko 1 bar e skema jokkondire nguleeki semi-isotropik huutortee. E nder golle balans e peewnugol, termostaat (61) mo njaaweeki mum ina huutoree ngam jokkondirde nguleeki poroteyiin, lipid e solvant. E nder golle ɗee fof, nguleeki kii ko 310K. Jokkondiral ngal aldaa e jokkondire hiisaama e peewnugol doggol jokkondire kuutortooɗe skema Verlet e muñal tampon 0,005. Helmere Coulomb ndee hiisaama e kuutoragol fannu gonɗo e mbaydi taƴndi 1,1 nm. Helmere Vander Waals ndee huutortoo ko peeje taƴɗe ɗe taƴre mum tolnii e 1,1 nm, peeje taƴɗe Verlet ɗee kuutortoo ko ngam ɓuuɓde (62).
Huutoraade VMD, njuuteendi ɓoggi taƴondirɗi hakkunde ɓuuɓri fosfaat DOPC walla ɓuuɓri seramiid AM1 e poroteyiin ko 0,7 nm, limoore lipiduuji jokkondirɗi e poroteyiin ina hiisee. E fawaade e foormulaaji ɗii, hiisa faktoriyaal ustaare-alɗude (DE) hono no (63) nii : faktoriyaal DE = (keewgol lipiduuji keewɗi e nder poroteyiin 0,7) e nder poroteyiin 0,7 (keewgol Cer e nder lipiduuji keewɗi) .
Nafoore ciimtol ngol heɓetee ko e hakkundeere, e barmeeji boowal ko koppiiji nay keertiiɗi SE. Nafoore limto faktor DE ina hiisee e jarribo t [(hakkunde DE-faktor-1)/SE]. Hiisaade teddeendi P ummoraade e peccitagol wutte gooto.
Kuutorgal GROMACS huutoraa ko ngam hiisaade kartal 2D densité latérale e nder njuɓɓudi ndi Emp24 woni e mum e nder 250 ns cakkitiiɗi ɗii e mbaydi ndii. Ngam heɓde kartal alɗude/ustaare seramiid, kartal densité Cer feccaa e kawral kartal Cer e DOPC, caggal ɗuum feccaa e njuuteendi Cer e nder ɓanndu. Ko noon kadi njuuteendi kartal colour huutortee.
Ngam heɓde geɗe ɓeydooje e ndee winndannde, ƴeew http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ko ɗum winndannde udditiinde renndinde e nder sarɗiiji Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, baawɗo huutoraade, renndinde e ƴellitde e kala fannu, so tawii kuutoragol timmungol ngol wonaa ngam heɓde nafoore njulaagu, tawa kadi ko miijo ngo woni wonde golle asliije ɗee ko goonga. Tendinowo.
Tesko: Min ñaagii ma tan ko yo a rokku adrees imeel maa mbele neɗɗo mo njiɗ-ɗaa wasiyaade hello ngoo ina annda aɗa yiɗi ɓe njiya imeel oo, tawa wonaa spam. Min nanngataa hay adrees imeel gooto.
Ngal naamnal huutortee ko ngam ƴeewde so tawii ko a njillu e haɗde neldude spam otomatik.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Natal 3D toowngal e sahaa goonga ina hollita nafoore njuuteendi caɗeele seramide ngam renndinde poroteyiin e nokkuuji yaltooji cuɓaaɗi.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Natal 3D toowngal e sahaa goonga ina hollita nafoore njuuteendi caɗeele seramide ngam renndinde poroteyiin e nokkuuji yaltooji cuɓaaɗi.
©2020 Fedde Ameriknaare ngam ɓamtaare ganndal. hakkeeji fof ina njogii. AAAS ko gollodiiɗo e HINARI, AGORA, OARE, KOOR, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. Ganndal ina yahra yeeso ISSN 2375-2548.