On njaaraama e njilluuji mon e Nature.com. Jaaynde feerorde nde kuutorto-ɗaa ndee ina famɗi ballal CSS. Ngam heɓde njeñtudi ɓurndi moƴƴude, min mbasiyii ma huutoraade mbaydi kesiri feerorde maa (walla softinde Mode Jokkondire e nder Internet Explorer). E nder ɗuum, ngam tabitinde ballal jokkondirngal, eɗen kolla lowre ndee tawa min mbaɗaani style walla JavaScript.
Asid propiyonik (PPA) ina huutoree ngam janngude darnde ŋakkere golle mitokondriyeeji e nder ñawuuji ƴellitaare ƴiiƴam ko wayi no ñawu mbaydi autism. PPA ina anndaa ina bonna biogenesis mitokondriyaal, mbayliigu, e mbayliigu. Kono tan, batte PPA e dinamiik mitokondriyeeji, fiɓnde e fusiyoŋ ina keddii e caɗeele sabu sifaa sahaa caɗtuɗo ɗeen peeje. Ɗoo, eɗen kuutoroo karallaagal ƴeewndo keewngal timmungal ngam wiɗtude no PPA waylirta mbaydi mitokondriyeeji, morfolooji, e dinamiik e nder geese SH-SY5Y nannduɗe e neron. PPA (5 mM) addani ustaare mawnde e nokku mitokondriyee (p < 0,01), njaajeendi Feret e cirƴam (p < 0,05), e nokku 2 (p < 0,01). Njiylawu nokkuure kewuuji mitokondriyeeji hollitii ɓeydagol mawngol (p < 0.05) e kewuuji fiɓnde e fusiyoŋ, ɗum noon ina jokki e jogaade nuunɗal reso mitokondriyeeji e nder ngonkaaji teskinɗi. Yanti heen, baylagol mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) e OPA1 (p < 0,05) ina usta no feewi. 01). Ɗum hollirta ko waylude morfolooji mitokondriyaal, bayyogenesis e dinamiik ngam jokkude golle e nder ngonkaaji mettuɗi. Dowlaaji men ina ndokka humpitooji kesi e batte PPA e dinamiik mitokondriyaal e teeŋtinde nafoore karallaagal ƴeewndo ngam janngude laabi njuɓɓudi caɗtuɗi jowitiiɗi e jaabawuuli stres mitokondriyaal.
Mitokondriyaaji ko tawtoraaɓe e golle cellal keewɗe ko ɓuri darnde mum en e peewnugol semmbe e biyosintesis. Metabolism mitokondriyaal ko reenoowo mawɗo baylagol kalsiyum, baylagol e redox homeostasis, baylagol ɓuuɓngol, waylude epigenetik, ɓeydagol taklon, feeñninde e maayde taklon porogaraam1. Haa teeŋti noon, mbayliigu mitokondriyaal ina waɗi nafoore mawnde e ƴellitaare neeruuji, nguurndam e golle mum en, kadi ina yaaji e nder peeñɗi neeruuji keewɗi2,3,4.
E nder duuɓi sappo jawtuɗi ɗii, ngonka mbaylaandi feeñii ko no njuɓɓudi caɗtundi neurogenesis, feeñninde, mawnugol e plastisite5,6. Ko ɓooyaani koo, morfolooji e dinamiik mitokondriyaal wontii geɗe teeŋtuɗe e nder mitosis, woni laawol dinamiik jogorngol jogaade poolgu mitokondriyaal celluɗo nder taklon. Dinamiik mitokondriyaal ina rewindaa e laabi caɗtuɗi jokkondirɗi gila e bayogenesis mitokondriyaal e bayoenerji haa e feccere mitokondriyaal, jokkondire, yah-ngartaa e laaɓtugol7,8. Taƴondiral kala e ɗeen peeje denndinooje ina bonna toppitagol resooji mitokondriyeeji celluɗi, ina jogii batte kuuɓtodinɗe e ƴellitaare ƴiiƴam9,10. Ndeke, ŋakkeende njuɓɓudi (disregulation) dinamiik mitokondriyaal ina teskaa e ñawuuji keewɗi e nder hakkille, e nder ƴiiƴam e nder ƴellitaare ƴiiƴam, ina jeyaa heen ñawuuji mbaydi autism (ASD)11,12.
ASD ko rafi ƴellitaare ƴiiƴam (neurodéveloppement heterogène) jogiiɗo arsitektuur genetik e epigenetik caɗtuɗo. Renugol ASD ngol luulndaaka, kono etiyoloji molekulaaji gonɗi les mum ɗii ina keddii ina pamɗi faamde. Moftugo bayaanuuji diga moodelji preclinical, janngirde nyawndiigu, e bayaanuuji molekulaaji multi-omics ina hokka seedamfaaguuji ɓeydotooɗi e ŋakkeende golle mitokondriyaal e nder ASD13,14. En mbaɗiino ko adii ɗuum ƴeewndo metilaasiyoŋ ADN e nder geenom e nder fedde ñawɓe ASD e anndude taƴe metilaasiyoŋ ceertuɗe mooftaaɗe e laabi mbayliigu mitokondriyeeji15. Caggal ɗuum min kaali metilaasiyoŋ ceertuɗo e reglementeeji hakkundeeji biogenesis e dinamiik mitokondriyeeji, ko ɗum jokkondiri e ɓeydagol limoore koppiiji mtDNA e waylude sifaa mbayliigu ƴiiƴam e nder ASD16. Dowlaaji men ina ɓeydoo hollude wonde dinamiik mitokondriyeeji e homeostasis ina njogii darnde mawnde e nder patofisiyoloji ASD. Ko ɗum waɗi, ɓeydude faamde mekanismaaji jokkondire hakkunde dinamiik mitokondriyaal, morfolooji, e golle ko huunde tiiɗnde e wiɗtooji jowitiiɗi e ñawuuji neeruuji baɗɗi ŋakkeende golle mitokondriyaal ɗiɗmere.
Teknikaaji molekulaaji ina keewi huutoreede ngam janngude darnde taƴe keertiiɗe e nder jaabawol baasal mitokondriyaal. Kono tan, ngool laawol ina waawi ustaade sabu sifaaji keewɗi e sahaaji ɗi kuutorɗe toppitiiɗe mitosis ɗee mbaɗata. Yanti heen, feeñninde taƴe mitokondriyaal ceertuɗe ko maande waylooji golle, haa teeŋti noon nde tawnoo ko taƴe seeɗa tan ɓuri ƴeewteede. Ko ɗum waɗi, laabi ɓurɗi laaɓtude ngam janngude golle mitokondriyaal e bioenerji ina teskini17. Morfolooji mitokondriyaal ina nanndi no feewi e dinamiik mitokondriyaal. Sifaa mitokondriyaal, jokkondiral mum, e mbaydi mum ina teskaa e peewnugol semmbe e nguurndam mitokondriyaal e cellal5,18. Yanti heen, geɗe ceertuɗe mitosis ina njokki e waylooji e nder morfolooji mitokondriyaal, baawɗi wonde joofnirɗe nafooje e ŋakkeende golle mitokondriyaal, kadi ina mbaawi wonde hujjaaji ngam wiɗtooji mekaniseeji garooji.
Morfolooji mitokondriyaal ina mbaawi yiyeede no feewi e huutoraade mikroskoop elektoronik (TEM), ko ɗuum addanta janngude no feewi mbaydi cellal. TEM ina yi’a no feewi morfolooji, mbaadiiji e mbaydi kiristaaji mitokondriyaal to resolution mitokondriyaal gooto gooto, wonaa tan e tuugnaade e binndol taƴe, baylagol poroteyiin walla parametruuji golle mitokondriyaal e nder denndaangal cellal17,19,20. Yanti heen, TEM ina wallita e janngude jokkondire hakkunde mitokondriyaaji e terɗe goɗɗe, ko wayi no retikulum endoplasma e otofagosomeeji, jogiiɗi darnde mawnde e golle mitokondriyaaji e homeostasis21,22. Nii woni, ɗum waɗi TEM ko fuɗɗoode moƴƴere ngam janngude ŋakkeende golle mitokondriyeeji hade mum waɗtude hakkille e laabi walla taƴe keertiiɗe. Nde golle mitokondriyaal ɓeydotoo jogaade faayiida e neuropatoloji, ina woodi haaju laaɓtuɗo ngam waawde janngude no feewi e no fotiri morfolooji e dinamiik mitokondriyaal e nder mbaydiiji neuronal in vitro.
E nder ndee winndannde, en ƴeewtindiima dinamiik mitokondriyeeji e nder mbaydi neuronik gonndi e ŋakkeende golle mitokondriyeeji e nder mboros spectrum autism. En kaaliino ko adii ɗuum metilaasiyoŋ ceertuɗo e karboksilaas beta (PCCB) e nder ASD15, woni feccere e enzim PCC karboksilaas mitokondriyee. Disregulaasiyoŋ PCC ina anndaa ina addana mooftude tooke e nder geese propiyoniil, ina heen asid propiyonik (PPA)23,24,25. PPA hollitaama ina bonna mbayliigu ƴiiƴam e waylude jikkuuji e nder nguurndam, kadi ko ɗum mbaydi daabaaji tabitndi ngam janngude laabi ƴellitaare ƴiiƴam jowitiiɗi e ASD26,27,28. Yanti heen, PPA ina wiyee ina bonna mbaawka membrane mitokondriyaal, biogenesis e fooftere e nder geese (in vitro) kadi ina huutoree no feewi ngam ƴeewde ŋakkeende golle mitokondriyaal e nder neronuuji29,30. Kono tan, batte ŋakkeende golle mitokondriyeeji baɗaaɗi e PPA e morfolooji e dinamiik mitokondriyeeji ina keddii ina pamɗi.
Ngoo wiɗto huutoriima karallaagal ƴeewndo kuuɓtodinngal ngam anndude batte PPA e morfolooji mitokondriyeeji, dinamiik, e golle e nder geese SH-SY5Y. Ko adii fof, min mbaɗii feere TEM ngam yiytude waylooji e nder morfolooji mitokondriyaal e ultrastruktuur17,31,32. Hono no sifaa diinaaji mitokondriyaaji33, min kuutoriima kadi ƴeewndo mbayliigu (MEL) ngam limtude waylooji e nder ballal hakkunde kewuuji fiɓnde e fusiyoŋ, limoore mitokondriyaaji e njuuteendi mum en e les njiimaandi PPA. E joofnirde, en ƴeewtindiima so tawii morfolooji e dinamiik mitokondriyaal ina njokkondiri e waylooji e baylagol taƴe gonɗe e biogenesis, fission, e fusiyoŋ. So en ƴettii yeru, dokke men ina kollita caɗeele laaɓtugol caɗeele kuutorɗe jowitiiɗe e dinamiik mitokondriyeeji. En teskiima nafoore TEM e janngude morfolooji mitokondriyaal ko no fotiri e joofnirde mitosis e nder geese SH-SY5Y. Yanti heen, eɗen teskii wonde dokke TEM ina ndokka humpito ɓurngo alɗude so tawii ina hawra e karallaagal ƴeewndo, tawa ina nannga kadi kewuuji diƴƴe ngam jaabaade baasal mbaylaandi. Ɓeydagol sifaaji laabi jokkondire molekulaaji ballitooji mitosis ɓiɗɓe leɗɗe nerwooji ina mbaawi rokkude humpito mawngo e nder geɗe mitokondriyaal e nder njuɓɓudi nerwooji e ñawuuji nerwooji.
Ngam saabaade baasal mitokondriyaal, ƴiye SH-SY5Y ɗee njuurnitaama PPA e kuutoragol 3 mM e 5 mM sodium propionate (NaP). Ko adii TEM, seedanteeje ɗee mbaɗaa e peewnugol seedanteeje kiriyojenik kuutortooɗe ɓuuɓri e ɓuuɓri toowndi (Natal 1a). Min mbaɗii feere ƴeewndo natal mitokondriyaal otomaatik ngam fooɗtude paaraaji morfolooji jeetati e nder denndaangal mitokondriyaal e nder mbaydiiji biyoloji tati. En tawii wonde safaara PPA waylii no feewi geɗe nay : nokku 2, nokku, perimeter, e njaajeendi Feret (Natal 1b–e). Wertallo 2 ina usta no feewi e 3 mM e 5 mM PPA fof (p = 0,0183 e p = 0,002, no njiyru-zen nih) (Natal 1b), tawi noon nokku (p = 0,003), perimeter (p = 0,0106) e njaajeendi Feret fof ustiima no feewi. Won ustaare mawnde (p = 0,0172) e nder fedde safrooɓe 5 mM so yerondiraama e fedde toppitiinde (Natal 1c–e). Ustagol mawngol e nokku e cirƴam hollitii wonde ƴiye safreteeɗe e PPA 5 mM ina njogii mitokondriyaaji ɓurɗi famɗude, ɓurɗi ɓuuɓde, tee ɗiin mitokondriyaaji ina pamɗi juutde e ƴiye ƴeewndorɗe. Ɗumɗoo ina yahdi kadi e ustaare mawnde e njaajeendi Feret, woni parametru keeriiɗo holliroowo ustaare ɓurnde mawnude hakkunde geese partikulaaji. Waylooji e nder ultrastructure kirisaaji ɗii njiytaama : kirisaaji ɗii ustii e les njiimaandi stres PPA (Natal 1a, panel B). Kono wonaa natal fof hollirta no feewi ultrastructure cristae, ɗum noon ƴeewndo keewngo e ɗeen mbayliigaaji waɗaaka. Ɗeeɗoo dokke TEM ina mbaawi hollirde geɗe tati baawɗe wonde : (1) PPA ina ɓeyda fiɓnde walla ina haɗa fusiyoŋ, addana mitokondriyaaji gonɗi ɗii ustaade mawneeki ; (2) ɓeydagol biogenesis ina addana mitokondriyaaji kesi, ɓurɗi famɗude walla (3) ina addana ɗi ɗiɗi fof e sahaa gooto. Hay so tawii ɗeen caɗeele mbaawaa seertude e TEM, mbayliigaaji morfolooji maantinɗi ina kollita mbayliigaaji e nder homeostasis e dinamiik mitokondriyeeji e nder baasal PPA. Caggal ɗuum min ƴeewtindiima paaraaji ɓeydooji ngam ɓeydaade sifaade ɗeen dille e mbaadiiji potɗi wonde les mum en.
Asid propiyonik (PPA) ina wayla sifaa mitokondriyeeji. (a) Nate mikroskoop elektoronik (TEM) kollitooje wonde mawneeki mitokondriyaaji ina ustoo, mitokondriyaaji ina ɓeydoo famɗude e ɓuuɓde e ɓeydagol safaara PPA ; 0 mM (mo ɓuuɓnaaka), 3 mM e 5 mM, no mbaydiiji ɗii fof. Ɓoggi boɗeeji ina kollita mitokondriyaaji. (b–e) Ɓowɗi SH-SY5Y safreteeɗi e PPA fotde 24 h peewniraa ko TEM, njeñtudi ndii ƴeewtaama e kuutoragol Fiji/ImageJ. Nayi e nder parametruuji jeetati ɗii kollitii ceertugol mawngol hakkunde ƴiye ƴeewndorɗe (ɗe njiytaaka, 0 mM PPA) e ƴiye njiylotooɗe (3 mM e 5 mM PPA). (b) Diiwaan 2, (c) Wertallo, (d) Taariindi, (e) Njaajeendi Feret. Njiylawu mbayliigu laawol gootol (kontrol vs. safaara) e jarribo Dunnett keewngo mbayliigu kuutoraa ngam anndude feere mawnde (p < 0.05). Toɓɓe dottaaɗe ina kolla tolno mitokondriyaal hakkundeejo wonande kala cellal, barmeeji boowal ina kolla tolno ± SEM. Dowlaaji kolliraaɗi ɗii ko n = 3, ko famɗi fof 24 cellal e nder rewtinnde kala ; ko ina tolnoo e 266 natal ƴeewtaama ; * hollirta ko p < 0,05, ** hollirta ko p < 0,01.
Ngam ɓeydaade sifaade no dinamiik mitokondriyeeji njaaborii PPA, min njuɓɓinii mitokondriyeeji ɗii e tetrametilrodamin etil ester (TMRE) e min kuutorii mikroskoop waktuuji e ƴeewndo MEL ngam ƴeewde nokkuuji e limtude mitokondriyeeji caggal waktuuji 24 e PPA 3 e 5 mM. Safrude kewuuji fission e fusion. (Natal 2a). Caggal ƴeewndo MEL, mitokondriyaaji ɗii ɓeydaama ƴeewteede ngam anndude limoore mbaydiiji mitokondriyaaji ɗii e keewal mum en. En teskiima ɓeydagol tokosol kono maantinngol e limoore kewuuji fiɓnde keɓtinaaɗi e 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] so renndinaama e fiɓnde [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] e fiɓnde [5,4 ± 0,5 (p < 0,05).] e fiɓnde [5,5.0.5.5]. 0.05)] <0.05)] kewuuji ɗii ɓeydiima no feewi e 5 mM so renndinaama e ƴeewndo (Natal 3b). Limre mitokondriyaaji ɓeydiima no feewi e 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] e 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Natal 3c) , tawi noon njuuteendi njuuteendi kala mbaydi mitokondriyaaji ina heddii ko waylaaki (Natal 3c). 3d). So ɗum ƴettaama e nokku gooto, ɗum ina hollita wonde waylude dinamiik mitokondriyaal ina waɗi jaabawol mbayliigu, jogorngol jogaade nuunɗal reso mitokondriyaal. Ɓeydagol limoore kewuuji fiɓnde e 3 mM PPA ina hollita wonde ɓeydagol limoore mitokondriyaal ina jeyaa e ko addani fiɓnde mitokondriyaal, kono so en ƴeewii wonde keewal mitokondriyaal ina heddii e ko ɓuri heewde ko waylaaki, biogenesis waawaa salaade wonde jaabawol ɓeydotoongol. Kono tan, ɗeeɗoo dokke ina kawri e mbaydiiji mitokondriyeeji ɓurɗi famɗude, cirƴaaɗi ɗi TEM yiyti, ina kollita kadi waylooji mawɗi e nder dinamiik mitokondriyeeji ɗi PPA addata.
Asid propiyonik (PPA) ina addana mbayliigu mitokondriyeeji ngam hisnude laaɓal reso. Ɓowɗi SH-SY5Y ina njiytee, ina njuutee e PPA 3 e 5 mM fotde waktuuji 24, ina njuutee e TMRE e Hoechst 33342 caggal ɗuum ƴeewndo MEL. (a) Nate mikroskoop gonɗe e sahaa (time-lapse) kollitooje colour e binndol ɓurngol tiiɗde e sahaa 2 (t2) wonande kala ngonka. Diiwanuuji cuɓaaɗi kollitooji e kala natal binndol ina ɓeydee, ina kollitee e 3D e sahaaji tati ceertuɗi (t1-t3) ngam hollirde dille e nder sahaaji ; kewuuji fusiyoŋ ina teskaa e ɓaleejo ; kewuuji fission ina teskaa e ɓaleejo. Kollitaaɗo e boɗeejo. (b) Hakindo limre kewuuji diinaaji e kala sarɗi. (c) Hakindo limre mbaydiiji mitokondriyeeji e nder cellal kala. (d) Hakindo njuuteendi (μm3) kala mbaydi mitokondriyaal e kala cellal. Dowlaaji kolliraaɗi ɗii ko n = 15 cellal e nder fedde safrooɓe kala. Barmeeji boowal kolliraaɗi ina kollita tolno ± SEM, barmeeji njuuteendi = 10 μm, * p < 0.05.
Asid propiyonik (PPA) ina addana taƴe jokkondirɗe e dinamiik mitokondriyaal ustude binndol. Ɓowɗi SH-SY5Y ina njuutee e PPA 3 e 5 mM fotde 24 h. Ko limtugol taƴe gonɗe e mbaydiiji ɗii waɗiraa ko e kuutoragol RT-qPCR, ɗum noon ko B2M. Taƴe ƴiiƴam (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 e (d) NFE2L2. Taƴe ɓuuɓɗe e ɓuuɓɗe (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 e (i) DRP1. Feereeji maantinɗi (p < 0,05) ƴeewtaama e kuutoragol ANOVA laawol gootol (kontrol vs. safaara) e jarribo Dunnett keewngo : * ina hollita p < 0,05, ** ina hollita p < 0,01, e **** ina hollita p < 0,0001. Baruuji ina kollita mbaydi ± SEM. Dowlaaji kolliraaɗi ɗii ko n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), e n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) mbaydiiji nguurndam.
Dowlaaji ummoriiɗi e wiɗtooji TEM e MEL ina kollita wonde PPA ina wayla morfolooji e dinamiik mitokondriyeeji. Kono ɗeen karallaagal ƴeewndorɗe ndokkaani humpito e ko fayti e kuutorɗe gonɗe les ɗee, ɗe njiylotoo ɗeen golle. Ko ɗum waɗi en ƴeewtindiima baylagol mRNA e nder njuɓɓudi 9 teeŋtundi e dinamiik mitokondriyaal, biogenesis, e mitosis ngam jaabaade safaara PPA. En limtii onkogen mieloma cellal (cMYC), faktor foofaango nukliyeer (NRF1), faktor mbayliigu mitokondriyee 1 (TFAM), faktor mbayliigu nannduɗo e NFE2 BZIP (NFE2L2), poroteyiin nannduɗo e gastrin 2 (STOML2), ɓuuɓri ƴiiƴam 1 (OPA1) (MiMFN21), Mitofu1 poroteyiin 1 jokkondirɗo e dinamin (DRP1) caggal waktuuji 24 safaara e PPA 3 mM e 5 mM. En teskiima 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 e p < 0,0001, no mbaydiiji ɗii fof) e 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) e safaara PPA. (Natal 3a-c). Ustagol baylagol mRNA ina fawii e doosgal : baylagol cMYC, NRF1 e TFAM ina usta laabi 5,7, 2,6 e 1,9 e 3 mM, e laabi 11,2, 3 e 2,2 e 5 mM. E ko feewti heen, taƴre biogenesis redox hakkundeere NFE2L2 waylaaka e kala njuuteendi PPA, hay so tawii noon ko nanndi e ɗuum, fawaade e doosgal, ustaare baylagol ina teskaa (Natal 3d).
En ƴeewtindiima kadi baylagol taƴe ɓooyɗe jeyaaɗe e reentaade fiɓnde e fusiyoŋ. STOML2 ina sikkaa ina jeyaa e fusiyoŋ, mitofaaji e biogenesis, tee baylagol mum ina usta no feewi (p < 0,0001) e 3 mM (mbayliigu 2,4) e 5 mM (mbayliigu 2,8) PPA (Natal 1). 3d). Ko noon kadi, baylagol taƴe fusiyoŋ OPA1 ustiima e 3 mM (mbayliigu 1,6) e 5 mM (mbayliigu 1,9) PPA (p = 0,006 e p = 0,0024, no mbaydiiji ɗii fof) (Natal 3f). Kono en njiytaani feere mawnde e baylagol taƴe fusiyoŋ MFN1, MFN2 walla taƴe fusiyoŋ DRP1 e les njiimaandi PPA 24-h (Natal 3g–i). Yanti heen, en njiyii wonde tolnooji poroteyiinuuji nay gonɗi e ɓuuɓri e ɓuuɓri (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) mbaylaaki e nder ngonkaaji gooti ɗii (Natal 4a–d). Ina teskaa wonde ɗeeɗoo dokke ina kollita toɓɓere wootere e sahaa, tee ina gasa tawa ɗe kollitaaka waylooji e nder baylagol poroteyiin walla toɓɓe golle e nder daawal gadanal stres PPA. Kono tan, ustaare mawnde e baylagol cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, e OPA1 ina hollita ŋakkeende mbayliigu mawngu e nder mbayliigu mitokondriyeeji, e nder nguurndam, e nder dinamiik. Yanti heen, ɗeeɗoo dokke ina kollita faayiida karallaagal ƴeewndo ngam janngude no feewi waylooji ngonkaaji joofnirɗe e nder golle mitokondriyaal.
Toɓɓere poroteyiin faktoruuji fusiyoŋ e fission waylaaki caggal nde asid propiyonik (PPA) safraa. Ɓowɗi SH-SY5Y ina njuutee e PPA 3 e 5 mM fotde 24 h. Toɓɓe poroteyiin limtaa ko e ƴeewndo Western blot, toɓɓe baylagol ɗee limtaama e poroteyiin fof. Hakindo baylagol poroteyiin e wakiliijo Western blots e poroteyiin target e total ina kollitee. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Baruuji ina kollita tolno ± SEM, e dokke kolliraaɗe ina kollita n = 3 rewtinnde biyoloji. Njiylawu keewngu (p < 0.05) wazaama e kuutoragol vursugol laawol gootol e vursugol Dunnett. Gel e blot asliiji ɗii kolliraama e Natal S1.
Ɓooygol mitokondriyaal ina jokkondiri e ñawuuji keewɗi, gila e ñawuuji mbaylaandi, ɓernde e ɓalndu haa e ñawuuji ƴiiƴam1,10. Ñawuuji keewɗi gonɗi e nder ɓalndu e gonɗi e nder ɓalndu ina njokkondiri e ŋakkeende golle mitokondriyaal, ina teskaa nafoore ɗeen ƴiye e nder nguurndam ngaandi fof. Ina jeyaa e ɗeen ñawanɗe ñawu Parkinson, ñawu Alzheimer e ñawu ASD3,4,18. Kono tan, heɓde ƴiye ngaandi ngam janngude ɗeeɗoo ñawanɗe ina saɗi, haa teeŋti noon e to bannge mekanik, waɗde feere mbele mbaydiiji cellal ina mbaawi wonde feere haannde. E nder ndeeɗoo wiɗto, eɗen kuutoroo mbaydi cellal kuutortoondi cellal SH-SY5Y safraangal PPA ngam ƴeewndaade ŋakkeende mitokondriyeeji yiytaaɗi e ñawuuji neeruuji, haa teeŋti noon e ŋakkeende mbaydi autism. Huutoraade ngool laawol PPA ngam janngude dinamiik mitokondriyeeji e nder neeruuji ina waawi addande en humpito e ko fayti e etiyoloji ASD.
En ƴeewtindiima mbaawka huutoraade TEM ngam yiytude waylooji e nder morfolooji mitokondriyaal. Ina teskaa wonde TEM ina foti huutoreede no moƴƴi ngam ɓeydude kattanɗe mum. Pewnugol ƴiye (cryo-specimens) ina addana en moƴƴinde reende mbaydiiji neeruuji tawa ina fiɓtoo e sahaa gooto geɗe cellal e ustude peeñgol artifakteeji34. E tuugnaade e ɗuum, en teskiima wonde ƴiye SH-SY5Y nannduɗe e neron ina njogii ƴiye gonɗe e les ƴiye ɗe ngalaa ko bonnata, e mitokondriyaaji juutɗi (Natal 1a). Ɗumɗoo ina hollita nafoore karallaagal peewnugol kiriyojenik ngam janngude morfolooji mitokondriyaal e nder mbaydiiji cellal neeruuji. Hay so tawii peeje keewɗe ina poti huutoreede ngam yuurnitaade doosɗe TEM, haa jooni alaa ko nanondiraa e hol paaraaji keertiiɗi potɗi fotde ngam tabitinde waylooji morfolooji mitokondriyaal. Tuugnaade e wiɗtooji keewɗi ƴeewndotooɗi keewal morfolooji mitokondriyeeji17,31,32, min mbaɗii tuugnorgal ƴeewndo natal mitokondriyeewal otomaatik, peewnoowo paaraaji morfolooji jeetati, woni : nokku, nokku2, njuuteendi mbaadi, perimeter, cirkulaarite, degere , njaajeendi Feret. e ronndo.
E nder majji, PPA ina usta no feewi nokku 2, nokku, perimeter, e njaajeendi Feret (Natal 1b–e). Ɗum hollitii wonde mitokondriyaaji ɗii ɓeydiima famɗude e ɓuuɓde, ɗum noon ina yahdi e wiɗtooji ɓennuɗi kollitooji ustaare nokku mitokondriyaaji caggal waktuuji 72 e nder stres mitokondriyaaji baɗaaɗi e PPA30. Ɗeeɗoo sifaaji morfolooji ina mbaawi hollude feccere mitokondriyaal, ko huunde haannde ngam seerndude geɗe bonɗe e nder laylaytol mitokondriyaal ngam wallitde ustaare mum en rewrude e mitofaaji35,36,37. To bannge goɗɗo oo, ustaare mawneeki mitokondriyaaji ina waawi jokkondirde e ɓeydagol biyogenesis, ko ɗum addanta mitokondriyaaji tokoosi jibinannde. Ɓeydagol fission walla biogenesis ina hollita jaabawol mbayliigu ngam jogaade mitosis e dow baasal mitokondriyaal. Kono tan, ustaare mawnugol mitokondriyaal, ŋakkeende fusiyoŋ, walla ngonkaaji goɗɗi mbaawaa ittude.
Hay so tawii natal toowngal ngal TEM tafi ngal ina addana en anndude sifaaji morfolooji to bannge mitokondriyaaji gooto gooto, ngalɗoo laawol ina addana en ƴeewde nate ɗiɗi e nder sahaa gooto. Ngam janngude jaabawuuli diinaaji e baasal mbaylaandi, min mbayli mitokondriyaaji e TMRE e min kuutorii mikroskoop time-lapse e ƴeewndo MEL, ko ɗuum addanta yiytude 3D toowɗo e waylooji e nder laylaytol mitokondriyaaji e nder sahaa33,38. En njiyii waylooji seeɗa kono maantinɗi e nder dinamiik mitokondriyeeji e les njiimaandi PPA (Natal 2). E 3 mM, limoore kewuuji fiɓnde ɓeydiima no feewi, tawi kewuuji fusiyoŋ ina keddii no ngoniri e ƴeewndo ngoo nii. Ɓeydagol limoore kewuuji fiɓnde e fusiyoŋ fof yiytaa ko e 5 mM PPA, kono ɗeen mbayliigaaji ina ɓadii njuuteendi, ina hollita wonde kinetik fijirde e fusiyoŋ ina njottoyoo e ballondiral e ɓuuɓri ɓurndi toowde (Natal 2b). Hakindo njuuteendi mitokondriyeeji ɗii waylaaki e PPA 3 e 5 mM fof, ko ɗum hollirta wonde laaɓal reso mitokondriyeeji ɗii ina reeni (Natal 2d). Ɗum ina hollita mbaawka resooji mitokondriyeeji diƴƴe ngam jaabaade ŋakkeende mbayliigu seeɗa ngam hisnude homeostasis tawa ina addana resooji ɗii feccude. E PPA 3 mM, ɓeydagol fiɓnde ina heddinoo ngam wallitde waylo-waylo e mbaydi kesiri, kono ko waylude kinetik ɓurnde luggiɗde ina ɗaɓɓi ngam jaabaade baasal ngal ɓeydagol PPA addata.
Limre mitokondriyaaji ina ɓeydoo e ɓuuɓri stres PPA ɗii fof, kono njuuteendi mitokondriyaaji ɗii waylaaki no feewi (Natal 2c). Ina gasa tawa ɗum addani ɗum ɓeydagol biogenesis walla ɓeydagol feccere ; kono so tawii ustaare mawnde alaa e nder njuuteendi mitokondriyeeji, ina gasa tawa biyosintesis ina ɓeydoo. Kono tan, doosɗe gonɗe e Natal 2 ɗee ina mballita e woodde laabi ɗiɗi mbayliigu : ɓeydagol kewuuji fiɓnde, jokkondirɗi e upregulation fiɓnde mitokondriyaal, e ɓeydagol keewal kewuuji, jokkondirɗi e biogenesis mitokondriyaal. E joofnirde, njoɓdi dinamiik ngam baasal seeɗa ina waawi wonde geɗe goote tawa ina waɗi fiɓnde, fusiyoŋ, biogenesis, e mitofaaji. Hay so tawii winndooɓe ɓennuɓe kollitii wonde PPA ina ɓeyda mitosis30,39 e mitofaaji29, eɗen ndokka seedeeji ngam waylude fiɓnde mitokondriyaal e dinamiik fiɓnde ngam jaabaade PPA. Ɗeeɗoo dokke ina kollita mbayliigaaji morfolooji ɗi TEM yiyti ɗii, ina ɓeyda kadi humpitooji e peeje jowitiiɗe e ŋakkeende mitokondriyeeji baɗaaɗi e PPA.
Sabu hay ƴeewndo TEM walla MEL rokkaani seedeeji laaɓtuɗi ko fayti e laabi jokkondire taƴe gonɗe les mbayliigaaji morfolooji teskaaɗi ɗii, min ƴeewtii baylagol RNA taƴe gonɗe e mbayliigu mitokondriyaal, biogenesis, e dinamiik. Proto-onkogen cMYC ko huunde teskinnde e nder reentaade mitokondriyaaji, glikolisis, asid amino e asid fattik40. Yanti heen, cMYC ina anndaa ina reena baylagol fotde 600 taƴre mitokondriyaal jeyaande e binndol, firo, e mooɓondiral kuuɓtodinngal, ina heen NRF1 e TFAM41. NRF1 e TFAM ko regleeji ɗiɗi cakkitiiɗi mitosis, gollotooɗi les PGC-1α ngam huutoraade mbayliigu mtDNA. Ndeeɗoo laawol ina huutoree e baylagol cAMP e AMPK, ina teskaa e njaru semmbe e baasal mbaylaandi. En ƴeewtindiima kadi NFE2L2, ko redox regulator biogenesis mitokondriyaal, ngam anndude so tawii batte PPA ina mbaawi jokkondirde e stres oksidaatiif.
Hay so tawii baylagol NFE2L2 ngol waylaaki, en njiyii ustaare jokkondire fawaade e doosgal e baylagol cMYC, NRF1 e TFAM caggal 24 h safaara e 3 mM e 5 mM PPA (Natal 3a–c). Doggol baylagol cMYC ina haalee ko adii ɗuum ko jaabawol stres mitokondriyaal42, e ko nanndi heen, dowlaaji baylagol cMYC ina waawi saabaade ŋakkeende golle mitokondriyaal tawa ina wayla mbayliigu mitokondriyaal, jokkondiral resooji, e polarisaasiyoŋ membran43. Ko ɓuri haawnaade heen, cMYC ina jeyaa kadi e reentaade fiɓnde e fusiyoŋ mitokondriyaal42,43, ina anndaa kadi ina ɓeyda fosforilaasiyoŋ DRP1 e nokkuuji mitokondriyaal e nder feccere ɓiɗɓe leɗɗe44, kam e jokkondire hakkunde mbayliigu morfolooji mitokondriyaal e nder ɓiɗɓe leɗɗe ƴiiƴam45. Ndeke, fibroblasteeji ɗi ngalaa cMYC ina kollita ustaare mawneeki mitokondriyeeji, ina yahdi e waylooji baɗeteeɗi e stres PPA43. Ɗeeɗoo dokke ina kollita jokkondire belɗe kono ɗe laaɓtaani tawo hakkunde cMYC e dinamiik mitokondriyaal, ina addana ɗum en faandaare welnde wonande wiɗtooji garooji ko fayti e mbayliigu PPA stres-induced.
Ustagol NRF1 e TFAM ina yahdi e darnde cMYC e nder njuɓɓudi binndol teeŋtundi. Ɗeeɗoo dokke ina kawri kadi e wiɗtooji ɓennuɗi baɗaaɗi e nder geese kanseer colonel aadee, kollitooji wonde PPA ina usta baylagol mRNA NRF1 e nder waktuuji 22, tawi noon ina jokkondiri e ŋakkeende ATP e ɓeydagol ROS46. Ɓeen winndooɓe kollitii kadi wonde baylagol TFAM ɓeydiima e waktuuji 8,5 kono artii e tolnooji puɗɗiiɗi ɗii e waktuuji 22. E ko feewti heen, Kim e al. (2019) hollitii wonde baylagol mRNA TFAM ina usta no feewi caggal 4 h stres PPA e nder geese SH-SY5Y ; kono caggal waktuuji 72, baylagol poroteyiin TFAM ɓeydiima no feewi, limoore koppi mtDNA ɓeydiima no feewi. Nii woni, ustaare limoore taƴe biyogenesis mitokondriyaal ɗe njiy-ɗen caggal waktuuji 24, haɗataa ɓeydagol limoore mitokondriyaal ina jokkondiri e ustude biyogenesis e sahaaji ɓennuɗi. Wiɗtooji ɓennuɗi kollitii wonde PPA ina ɓeyda no feewi mRNA e poroteyiin PGC-1α e nder geese SH-SY5Y e nder waktuuji 4 e hojomaaji 30, tawi noon asid propiyonik ina ɓeyda biogenesis mitokondriyee e nder hepatositteeji nagge rewrude e PGC-1α e nder waktuuji 12 e hojomaaji 39. Ko ɓuri haawnaade heen, PGC-1α wonaa tan reenoowo binndol toowngol NRF1 e TFAM, kono kadi hollitaama ina reentoo golle MFN2 e DRP1 e reentaade fission e fusion47. So en ƴettii yeru, ɗum ina teeŋtina jokkondire tiiɗɗe hakkunde laabi jowitiiɗi e jaabawuuli mbayliigu mitokondriyeeji ɗi PPA addata. Yanti heen, dokke men ina kollita ŋakkeende mawnde e nder njuɓɓudi binndol biogenesis e metabolism e nder baasal PPA.
Taƴe STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1 ina njeyaa e jokkondire hakkundeeje peccitagol, jokkondire e dinamiik mitokondriyaal37,48,49. Won taƴe goɗɗe keewɗe naatɗe e dinamiik mitokondriyaal, kono STOML2, OPA1 e MFN2 ina tawee ko adii ɗuum ina ceerti e metilaasiyoŋ e nder kohorteeji ASD,16 e wiɗtooji keewɗi keertiiɗi kollitii waylooji e ɗeen geɗe binndol ngam jaabaade baasal mitokondriyaal50,5. 52. Feññinde OPA1 e STOML2 fof ina usta no feewi e 3 mM e 5 mM PPA (Natal 3e, f). OPA1 ina jeyaa e regleeji ɓooyɗi jokkondire mitokondriyaal rewrude e jokkondiral toowngal e MFN1 e 2, ina jogii darnde e waylude kiristaaji e morfolooji mitokondriyaal53. Darnde STOML2 laaɓtunde e nder dinamiik mitokondriyaal ina heddii ko laaɓtaani, kono seedeeji ina kollita wonde ina jogii darnde e nder jokkondire mitokondriyaal, e biogenesis, e mitofaaji.
STOML2 ina jeyaa e jogaade jokkondire fooftere mitokondriyaal e peeñgol komplekseeji caɗeele fooftere54,55, tee ina hollita wonde ina wayla no feewi sifaaji mbaylaandi e nder geese kanseer56. Wiɗtooji kollitii wonde STOML2 ina ɓamta mbaawka membrane mitokondriyaal e biogenesis rewrude e jokkondiral e BAN e kardiyolipin 55, 57, 58. Yanti heen, wiɗtooji keertiiɗi kollitii wonde jokkondiral hakkunde STOML2 e PINK1 ina reena mitofaaji59,60. Teskaama wonde STOML2 ina wiyee ina jokkondiri e MFN2 e dartinde ɗum, kadi ina jogii darnde mawnde e dartinde isoformeeji OPA1 juutɗi, tawa ina haɗa protease baawɗo ustude OPA153,61,62. Ustagol baylagol STOML2 yiytaangol e nder mbayliigaaji PPA ina waawi addande ɗeen poroteyiinuuji fusiyoŋ ɓurde waawde ustaade rewrude e laabi baɗɗiiɗi e ubiquitin e proteasome48. Hay so tawii darnde STOML2 e OPA1 laaɓtunde e nder jaabawol diƴƴe PPA laaɓtaani, ustaare baylagol ɗeen taƴe fusiyoŋ (Natal 3) ina waawi bonnude ballondiral hakkunde fijirde e fusiyoŋ, addana ɗum ustaade mawneeki mitokondriyeeji (Natal 3). 1).
To bannge goɗɗo oo, baylagol poroteyiin OPA1 ngol waylaaki caggal 24 h, tawi noon mRNA e poroteyiin MFN1, MFN2 walla DRP1 waylaaki no feewi caggal nde PPA safraa (Natal 3g-i, Natal 4). Ɗum ina waawi hollude wonde alaa waylooji ngoni e nder njuɓɓudi ɗee geɗe baɗɗe faayiida e nder jokkere enɗam e fiɓnde mitokondriyaal. Kono tan, ina haani teskeede wonde kala e ɗeeɗoo taƴe nayi ina jokkondiri kadi e waylooji caggal binndol (PTMs) jogorɗi ƴellitde golle poroteyiin. OPA1 ina jogii sifaaji jokkondire jeetati ceertuɗi e nder mitokondriyaaji ngam feewnude isoformeeji ɗiɗi ceertuɗi 63 . Balance hakkunde isoformeeji juutɗi e juutɗi ina hollita darnde OPA1 e nder jokkondire mitokondriyaal e toppitagol reso mitokondriyaal64. Golle DRP1 ina njuɓɓinee e fosforilaasiyoŋ poroteyiin kinaas II (CaMKII) baɗɗo kalsiyum/kalmodulin, tawi noon ustude DRP1 ina njuɓɓinee e ubikitinaasiyoŋ e SUMOylaasiyoŋ65. E joofnirde, DRP1 e MFN1/2 fof ko GTPases, ɗum noon golle ina mbaawi battinde e tolno peewnugol GTP e nder mitokondriyaaji 66 . Ko zuum wazi, hay so tawii baylagol ziin poroteyiin ina heddii, ina gasa tawa zum hollirtaa golle poroteyiin walla nokkuuji zi mbaylaaki67,68. Ndeke, repertooji poroteyiin PTM gonɗi ɗii ina keewi wonde dingiral gadanal ngam haɓaade jaabawuuli stres ɓuuɓɗo. E nder woodgol stres metabolik moƳƳo e nder moodel men, ina gasa tawa PTM ina addana ɓeydagol golle poroteyiinuuji fusiyoŋ e fiɓnde ngam artirde no haanirta nii timmugol mitokondriyeeji tawa ina ɗaɓɓi ɓeydagol golle ɗeen taƴe to tolno mRNA walla poroteyiin.
So en ƴettii yeru, doosɗe gonɗe dow ɗee ina kollita njuɓɓudi morfolooji mitokondriyaal caɗtundi e fawaade e sahaa e caɗeele laaɓtugol ɗeen peeje. Ngam janngude baylagol taƴe, ko adii fof ina haani anndude taƴe keertiiɗe gonɗe e laawol ngol. Kono tan, dokke men ina kollita wonde taƴe gonɗe e laawol gootol njaabotaako no feewi e stres gooto. E goonga, wiɗtooji ɓennuɗi kollitii wonde taƴe ceertuɗe e nder laawol gootol ina mbaawi hollirde sifaaji jaabawol waktuuji ceertuɗi30,46. Yanti heen, ina woodi geɗe caɗtuɗe caggal binndol, ɗe mbonnata jokkondire hakkunde binndol e golle taƴe. Janngirɗe poroteyiin ina mbaawi rokkude humpito e batte PTM e golle poroteyiin, kono kadi ina addana ɗum en caɗeele ko wayi no laabi ɓuuɓɗi, njuuteendi signal-to-noise toowndi, e ŋakkeende ƴellitaare.
E nder ɗuum, janngude morfolooji mitokondriyaal kuutortooɗi TEM e MEL ina jogii mbaawka mawka ngam jaabaade naamne teeŋtuɗe jowitiiɗe e jokkondire hakkunde dinamiik mitokondriyaal e golle mum e no ɗum jogori battinde e ñawu nguu. Ko ɓuri teeŋtude, TEM ina rokka feere toownde ngam fooɗtude morfolooji mitokondriyeeji ko wayi no jokkere enɗam hakkunde ŋakkeende golle e dinamiik mitokondriyeeji51. MEL ina rokka kadi feere laaɓtunde ngam yiytude kewuuji fission e fusion e nder nokkuuji cellal diidi tati, ina addana limtude mbayliigu mitokondriyaal dinamiik hay so tawii waylooji ngalaa e baylagol taƴe33. Ɗoo eɗen teskii nafoore karallaagal ƴeewndo mitokondriyaal e nder ñawuuji mitokondriyaal ɗiɗaɓi. Ɗeeɗoo ñawanɗe ina keewi anndeede e baasal gonngal e nder ɓalndu, ngal nganndu-ɗaa ko waylude no feewi resooji mitokondriyaal, wonaa bonnude mitokondriyaal no feewi. Kono tan, njoɓdi mitokondriyaal ndi ina ɗaɓɓi ngam hisnude mitosis e nder baasal gonngal e ɓuuɓri ina jogii batte kuuɓtodinɗe. E nder ganndal neurobiyoloji, faamde no moƴƴi ɗeen peeje mbayliigu ina waawi addande en humpitooji keewɗi ko faati e neuropatoloji pleyotropik jokkondirɗi e ŋakkeende golle mitokondriyaal.
E joofnirde, dokke men ina kollita nafoore karallaagal ƴeewndo ngam faamde batte kuuɓtodinɗe jokkondire caɗtuɗe hakkunde baylagol taƴe, waylude poroteyiin, e golle poroteyiin jokkondirɗe e dinamiik mitokondriyeeji neeruuji. En kuutoriima PPA ngam ƴeewde ŋakkeende golle mitokondriyee e nder moodel cellal neuronal ngam heɓde humpito e nder feccere mitokondriyee ASD. Piɓaaji SH-SY5Y safreteeɗi e PPA kollitii waylooji e morfolooji mitokondriyeeji : mitokondriyeeji ɗii mbaɗti wonde tokoosi e cirƴaaɗi, tee kiristaaji ɗii ina pamɗi no feewi so ɗi ƴeewtaama e TEM. Njiylawu MEL hollitii wonde ɗeen mbayliigaaji ina mbaɗa e sahaa gooto e ɓeydagol kewuuji fiɓnde e fusiyoŋ ngam hisnude jokkere enɗam e nder jaabawol ŋakkere mbaylaandi seeɗa. Yanti heen, PPA ina bonna no feewi njuɓɓudi binndol mbayliigu mitokondriyaal e homeostasis. En teskiima cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, e OPA1 ko njuɓɓudi mitokondriyeeji teeŋtundi ndi stres PPA bonnata, ina mbaawi kadi jogaade darnde e jokkondire mbayliigaaji baɗeteeɗi e PPA e nder morfolooji e golle mitokondriyeeji. Wiɗtooji garooji ina njiɗaa ngam moƴƴinde sifaade waylooji wakkatiiji baɗeteeɗi e PPA e nder baylagol taƴe e golle poroteyiin, e nokkuuji, e waylooji caggal firo. Dowlaaji men ina kollita caɗeele e jokkondire hakkunde laabi jokkondire hakkunde jaabawol teskuyaaji mitokondriyeeji e hollirde nafoore TEM e karallaagal ƴeewndo goɗɗal ngam wiɗtooji laabi ɓurɗi tiiɗde.
Ko mbaydi ƴiiƴam SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) soodaa e Sigma-Aldrich. Ɓoornugol SH-SY5Y ina mawni e nder ɓuuɓri gonndi e ɓuuɓri gonndi e ɓuuɓri gonndi e ɓuuɓri (DMEM/F-12) e L-glutamine (SC09411, ScienCell) e nder ɓuuɓri 25 cm2 ɓeydaandi e 20% e ƴiiƴam nagge ɓiɗɗo (F4BS911) . e 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) e nguleeki 37 °C, 5% CO2. Piɓaaji ɗii njuppaama haa 80% e ɓuuɓri tawa ina kuutoroo 0,05% e tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), ɗi njuppaa e 300 g, ɗi njuppaa e ɓuuɓri ko ina tolnoo e 7 × 105 piɓaaji/ml. Fooyre ndee fof waɗiraa ko e ƴiye SH-SY5Y ɗe ceerndaaka hakkunde paaspooruuji 19–22. PPA ina njuɓɓinee no NaP nii. Ƴeewee ɓuuɓri NaP (CAS n° 137-40-6, foormula kemikal C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) e nder ndiyam MilliQ ngulɗam haa 1 M, ndewa e nguleeki 4 °C. Ñalnde safaara oo, ɓuuɓna ndeeɗoo ɓuuɓri e PPA 1 M haa 3 mM e PPA 5 mM e nder nokku mo ƴiiƴam alaa (DMEM/F-12 e L-glutamine). Hakindo safaara e jarribooji ɗii fof alaa PPA (0 mM, ƴeewndo), 3 mM, e 5 mM PPA. Fooyre ndee waɗiraa ko famɗi fof e mbaydiiji biyoloji tati.
Piɓaaji SH-SY5Y ina njuutee e ɓuuɓri 25 cm5 e tolno 5,5 × 105 piɓaaji/ml, ina mawnina fotde waktuuji 24. Jabet PPA oo ɓeydaama e ɓuuɓri ndii hade 24 h ɓuuɓri ndii. Moftu pelle cellal rewrude e porotokolle subculture tissue mammal no woorunoo (ko siforaa dow). Sosde pellet cellal oo e nder 100 μl 2,5% glutaraldehiid, 1× PBS, resde ɗum e 4 °C haa nde ɗum huutoree. Ɓowɗi SH-SY5Y ɗii njuumtaama ko juuti ngam pellitde piɓaaji ɗii e ittude 2,5% glutaraldehiid, 1× ɓuuɓri PBS. Resndinde ƴiiƴam ɗam e nder gel agarose 4% peewnaaɗo e ndiyam ɓuuɓɗam (jokkondiral agarose e ɓuuɓri ƴiiƴam ko 1:1). Pecce agarose mbaɗaa e dow gris e dow laylayti daneeji, ɓuuɓnaa e 1-heksadesen hade mum en ɓuuɓde e tolno nguleeki toowki. Sammbaaji ɗii njuumtaama e asetoon joorɗo 100% e -90°C fotde waktuuji 24. Ndeen nguleeki kii ɓeydaama haa -80°C, ɓeydaa heen ɓuuɓri 1% tetroksiid osmiyum e 0,1% glutaraldehiid. Sammbaaji ɗii ndewaama e -80°C fotde waktuuji 24. Caggal ɗuum, nguleeki kii ɓeydaama seeɗa-seeɗa haa nguleeki suudu e nder balɗe keewɗe : gila – 80 °C haa – 50 °C fotde waktuuji 24, haa – 30 °C fotde waktuuji 24, haa – 10 °C fotde waktuuji 24 haa caggal ɗuum haa nguleeki suudu. wulol.
Caggal peewnugol kiriyojenik, ƴeewndorɗe ɗee njuppaa e resin, taƴe ɓutte (∼100 nm) mbaɗaa e kuutoragol ƴulɓe Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Taƴe ɗee njuumtaama e asetaat uranil 2% e sitraat plumbum. Sammbaaji ɗii njiytaa ko e kuutoragol mikroskoop elektoronik gonɗo e jolngo FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (FEI ko adii), Eindhoven, Pays-Bas) golloowo e 200 kV (jolngo Lab6) e kamera CCD Gatan (Gatan, Angalteer) jogiiɗo filtirde semmbe Tridiem.
E nder kala ƴeewndo karallaagal, ko famɗi fof 24 natal cellal gootal keɓaama, tawi ko 266 natal. Nate ɗee kala ƴeewtaama e kuutoragol makro Diiwaan Nafoore (ROI) e makro Mitokondriya. Makro mitokondriyal tuugii ko e laabi baylaaɗi17,31,32 e ina addana en waɗde batte semi-otomaatik e natal TEM e nder Fiji/ImageJ69. E raɓɓiɗinaade : natal ngal ina waylee e ina waylee e huutoraade ittugol balɗe 60 (60 piksel radiis) e filtirde bandpass FFT (kuutoragol keeri dow e les 60 e 8 piksel) e suppression line verticale e muñal orientation 5%. Natal gollorngal ngal ina ustoo otomatik e huutoraade algoritme entropi ɓurɗo mawnude e mask binndol ina feewnee. Nokkuuji natal jokkondirɗi e ROIs cuɓaaɗi e junngo e nder natal TEM raw ƴettaa, ina cifa mitokondriyaaji e ittude membrane plasma e nokkuuji goɗɗi toowɗi mbayliigu. Kala ROI ƴettaaɗo, partikulaaji binndaaɗi ɓurɗi 600 piksel ƴeewtaama, kadi nokku partikulaaji ɗii, perimeter, aksiyonji mawɗi e tokoosi, njaajeendi Feret, cirƴagol, e cirƴagol ina pooɗee e kuutoragol golle pooɗondiral mahraaɗe e nder Fiji/ImageJ. Caggal Merrill, Flippo, e Strack (2017), nokku 2, njuuteendi partikel (njuuteendi aksiyoŋ mawɗo e tokooso), e faktoriyaal mbaadi (FF) hiisaama e ɗeen doosɗe, ɗo FF = perimeter 2/4pi x nokku. Sifaa foorma parametrik ina tawee e Merrill, Flippo, e Strack (2017). Makrooji kaaleteeɗi ɗii ina tawee e GitHub (ƴeew bayyinaango keɓgol dokke). Hakindo, ko ina wona 5 600 partikel ina njuurnitee e kala safaara PPA, zum wonnoo ko ina wona 17 000 partikel (doggi zi kollittaaka).
Ɓowɗi SH-SH5Y mbaɗaa e nder laylayti pinal 8 (ThermoFisher, #155411) ngam newnude jokkondire jamma, caggal ɗuum ɓuuɓnaa e TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) e Hoechst 33342 H:200 (SigmaA600-200). daneejo. Nate keɓaama e kuutoragol laseruuji 405 nm e 561 nm e nder weeyo 10 min, e nate raw keɓaama e z-stacks ina waɗi mikroogaraafi natal 10 e az step 0.2 μm hakkunde kaɓirɗe natal e toɓɓe waktuuji 12 garooji . Nate ɗee mooftaa ko e kuutoragol lowre ɓurnde yuumtude (Carl Zeiss, Oberkochen, Almaañ) e kuutoragol lowre LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Nate ɗee ƴeewtaama e ImageJ e kuutoragol pipeline sifotoonde ko adii e plugin ImageJ ngam fooɗtude kewuuji fusiyoŋ e fission, limoore hakkundeere mbaydiiji mitokondriyeeji, e limoore hakkundeere njuuteendi mitokondriyeeji e kala cellal33. Makrooji MEL ina tawee e GitHub (ƴeew bayyinaango keɓgol dokke).
Ɓowɗi SH-SY5Y ina njuutee e ɓulli jeegom e nder njuuteendi 0,3 × 106 ɓiɗɓe leɗɗe/mL fotde waktuuji 24 hade mum en safreede. ARN yaltinaa ko e kuutoragol porotokol Quick-RNATM Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) e waylooji seeɗa : ɓeydu heen 300 μl tampon limto ARN e kala ɓuuɓri hade mum ittude e limde kala sample ko no feere sakkitiinde e 30 μl limto DNase/RNase. -ndiyam mbelɗam. Denndaangal seedanteeje ɗee ƴeewtaama ngam anndude keewal e moƴƴere e kuutoragol ƴulɓe NanoDrop ND-1000 UV-Vis. Tolno poroteyiin ummoriiɗo e lisaas cellal heɓaama e kuutoragol 200 μl tampon lisaas RIPA, e limto poroteyiin e kuutoragol ƴeewndo poroteyiin Bradford70.
Sintesis ADN waɗiraa ko e kuutoragol Kit Sintesis ADN TetroTM (BIO-65043, Meridian Bioscience) e fawaade e jamirooje peewnoowo oo e won e waylooji. cDNA sinndaama e nder 20-μl reaksiyonji kuutortooɗi 0,7 haa 1 μg ARN keewɗo. Primeruuji cuɓaama e binndanɗe 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 bayyinaaɗe ko adii (Tablo S1) e sonduuji jahduɗi heen ɗii peewniraa ko kuutorgal PrimerQuest ummoraade e Karallaagal ADN kuuɓtidinngal. Denndaangal taƴe nafooje ɗee, njuɓɓinaama e taƴre B2M nukliyeer. Ko RT-qPCR fotnoo ƴeewde ko feewti e taƴre STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC e OPA1. Kosam mawɗam ɗam ina waɗi polimeraas LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM ɓuuɓri yeeso e caggal, ADN cDNA, e ndiyam PCR-grade ngam heɓde ɓuuɓri timmundi 10 μL e kala ɓuuɓri. Feññinde taƴe feccere e feccere (DRP1, MFN1/2) fotnoo ko huutoraade ƴeewndorɗe keewɗe TaqMan. Ko mbaydi qPCR (M3004S, New England Biolabs) huutoraa e fawaade e jamirooje peewnoowo oo, tawa ina waɗi waylooji seeɗa. Kosam RT-qPCR keewɗam ina waɗi polimeraas 1X LUNA Taq, 10 μM primeruuji yeeso e caggal, 10 μM sonndu, cDNA, e ndiyam PCR-grade, ko ɗum addanta ɓuuɓri timmundi 20 μL e kala feere. RT-qPCR waɗiraa ko e kuutoragol 6-plex (QIAGEN RG—limre : R0618110). Sarɗiiji welo-welo kolliraama e alluwal S1. Denndaangal seedanteeje cDNA ɗee ɓeydaama e nder laylayti tati, tawa kadi ko mbaydi mbaylaandi (standard curve) feewnaa e kuutoragol limlebbi sappo. Outliers e nder sampleeji tati zi tawa ina njogii vursugol vursugol (Ct) >0.5, ittaama e vursugol ngol ngam tabitinde vursugol doosze30,72. Ko feeñninde taƴe gonɗe e mbaydi 2-ΔΔCt79 hiisaama.
Ƴeewirde poroteyiin (60 μg) jillondiraama e tampon loowdi Laemmli e 2:1, doga e gel poroteyiin mo alaa no 12% (Bio-Rad #1610184). Poroteyinuuji ɗii mbaɗtaa e ɓuuɓri PVDF (fluoriid poliviniliden) (#170-84156, Bio-Rad) e kuutoragol mbaydi Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membraan oo udditaa, ɓuuɓnaa e ƴiye gadane potɗe (OPA1, MFN1, MFN2, e DRP1) (diluted 1:1000) fotde waktuuji 48, caggal ɗuum ɓuuɓnaa e ƴiye ɗiɗmere (1:10 000) fotde waktu 1. Ndeen memmbaanuuji ɗii ƴettaa ko e kuutoragol lowre ECL hirnaange (#170-5061, Bio-Rad) e kuutoragol mbaydi MP Bio-Rad ChemiDoc. ImageLab mbaydi 6.1 huutoraa ko ngam ƴeewndaade mbaydiiji hirnaange. Gel e blot asliiji ɗii kolliraama e Natal S1. Kabaaru antibiotik ina tawee e alluwal S2.
Dowlaaji zi kollitaama ko no njuvvudi e njuumri njuumri (SEM) ko famzi fof e sammeeji tati keertiizi zi. Dowlaaji ɗii ƴeewtaama ngam anndude so tawii ko ɗi no woorunoo e kuutoragol jarribo Shapiro-Wilks (so wonaa tawa ko noon hollirtee) hade mum en ƴettude peccitagol Gaussian e mbaydiiji potɗi e jokkude e wiɗtooji ɗii. Gaa gaa ƴeewtaade doggol doosɗe kuutortooɗe LSD MEL Fisher (p < 0,05), ANOVA laawol gootol (moƴƴere safaara e ƴeewndo), e jarribo ƴeewndo keewngo Dunnett ngam anndude nafoore (p < 0,05). Nafooje p maantinɗe kolliraama e nate ɗee ko *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denndaangal wiɗtooji e nate limtooje mbaɗaama, peewniraa ko e kuutoragol GraphPad Prism 9.4.0.
Makrooji Fiji/ImageJ ngam ƴeewndaade natal TEM ina tawee e GitHub : https:// Makro njiylawu kewuuji mitokondriyeeji (MEL) ina tawee e GitHub : https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM e Vijaya A. Mitokondriyaaji : koolaaɗo kuuɓal mbayliigu, mbayliigu, baasal, duuɓi e epigenetik. Indoneesi. Ganndal safaara nguurndam. J. 13, 221-241 (2021).
Ben-Shachar, D. Ɓooygol mitokondriyeeji keewɗi e nder sikki-sakka, kompleks I ko huunde waawnde wonde paandaale pathogenic. Sikizofreni. jawdi. 187, 3-10 (2017).
Bose, A. e Beal, MF Ɓooygol mitokondriyeeji e nder ñawu Parkinson. J. Neurokimiya. 139, 216-231 (2016).
Sharma VK, Singh TG e Mehta V. Mitokondriyaaji teskinɗi : paandaale njiimaandi e ñawu Alzheimer. Mitokondriyaaji 59, 48-57 (2021).
Mitokondriyaaji e ngaandi : bioenerji e ko nanndi heen. Tookeeji ƴiiƴam. jawdi. 36, 219-238 (2019).
Rangaraaju, V. e woɗɓe. Mitokondriyaaji pleyotropik : batte mitokondriyaaji e ƴellitaare neeruuji e ñawu. J. Ganndal ƴiiƴam. 39, 8200-8208 (2019).
Kardaño-Ramos, C. e Morais, V. A. Biyogenesis mitokondriyaal e nder neeruuji : hol no e hol to. hakkunde leyɗeele. J. Moor. ganndal ngal. 22, hitaande 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. e Zhao, J. Reglementaasiyoŋ dinamiik mitokondriyeeji mammal : fartaŋŋeeji e caɗeele. yeeso. endokrin. (Lozan) 11, 374 (2020).
Khacho, M. e Slack, RS Dinamiik mitokondriyeeji e nder reentaade ƴiiƴam : gila e ngaandi ƴellitoori haa e ngaandi mawndi. yahde yeeso. dinamiik. 247, 47-53 (2018).