Jooni†Adres hannde: OX11 0DE, Angalteer, suudu Diamond, nokku ganndal e kesam-hesamaagu Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Angalteer, Co.
Koolaaɗo kuuɓal 1 (RC-LH1) woni ko ɓuri teeŋtude e fotosintesis bakteriiji fototrofik purpur. En mbaɗii heen mbaydiiji ɗiɗi mikroskoop kiriyo-elektron e nder njuɓɓudi RC-LH1 ummoriindi e Rhodopseudomonas palustris. Koolondiral 2,65-Å e nder njuuteendi RC-LH114-W ina waɗi 14 loope LH1 taariiɗe RC, tawi ko poroteyiin W taƴata ɗum, tawi noon njuuteendi ndi alaa poroteyiin-W ko mbaydi RC timmundi taarotoondi RC. Udditgol 16 lowre LH1 loop. Njiylawu ɗeen ɗoon mbaydiiji ina rokka humpitooji ko faati e dinamiik kinon e nder njuɓɓudi RC-LH1, ina heen mbayliigaaji konformaasiyoŋ ɗi nganndaaka ko adii nde kinon jokkondirta e nokku RC QB, kam e nokku ɗo kinon jokkondirta e nokku RC QB, kam e nokku ɗo kinon jokkondirta, balloowo Pass them to RC. Sifaa keeriiɗo poroteyiin W ina haɗa uddugol loowdi LH1, ɗum noon ina addana laawol yaawnaade mbayliigu kinon/kinon.
Semmbe mo fotosintesis rokkata ina waawi jogaade ko famɗi fof nguurndam e dow leydi, kadi ina jogii mbaawka mawka e karallaagal nguurndam naange. So tawii ina ɓamta fotosintesis aduna, bakteriiji fototrofik purpur ina kollita kadi mbaadiiji semmbeeji keewɗi e mbaawkaaji mbayliigu. Eɗe mbaawi daɗde e fotosintesis, eɗe mbaawi mawnude no bakteriiji heterotrofik nii e nder niɓɓere, eɗe mbaawi fiɓde azot e gaas karbonik, eɗe mbaawi feewnude hidrogen, eɗe mbaawi kadi ustude mbaydiiji aromatik (1-3). Ngam heɓde semmbe e ɗeen golle, alaa e sago annoore waylee e yaawre e no haanirta nii, waɗta ɗum semmbe kemikal. Ndee feere fuɗɗotoo ko nde kompleks antenaaji nanngoowo annoore oo moofti annoore, nawta semmbe nanngaaɗo oo to nokku gonɗo e ɓuuɓde (RC), ɗum fuɗɗoo seerndude charge (4 – 7). Yuɓɓo fotosintesis teskinngo e nder bakteriiji fototrofik purpur ina waɗi RC mo sifaa 2, tawi ina taarnaa e kompleks 1 (LH1) mooftirɗo annoore, ko ɗum woni kompleks core RC-LH1. LH1 ina sosaa e mbaydi heterodimereeji αβ ɓuuɓɗi, heen gooto fof ina jokkondiri e molekule kulorofil bakteriiji ɗiɗi (BChl) e karotenoid gooto walla ɗiɗi (8-12). Antena LH1 ɓurɗo hoybude oo ina waɗi 16 walla 17 heterodimer αβ taarotooɗo RC (9-13) e nder loocol udditiingol, kono e nder komplekseeji goɗɗi gonɗi e nder ɓalndu, peptideeji transmembrane ina taƴa jokkondiral LH1 taariindi , Ko noon kadi ina ɓeyda diffusion kinol/kinon e kompleks bRC1, 13-15). Leɗɗe fototrofik purpure biyeteeɗo Rhodopseudomonas (Rps.) ko tagoore mbaydi mbaawnde faamde semmbe e mbayliigu elektoronik ballitoowo fotosintesis. Ko adii fof ko mbaydi kiriis Rps. Model RC-LH1 palustris ko RC, taarotooɗo 15 loope LH1 heterodimerik, ɗe taƴaa e poroteyiin mo anndaaka, biyeteeɗo “Protein W” (14). Caggal ɗuum, poroteyiin-W anndaa ko RPA4402, woni poroteyiin 10,5kDa mo alaa sifaa, mo heliiseeji tati teskaaɗi (TMH) (16). Eɗen njiɗi waylude innde taƴre rpa4402 gonnde e poroteyiin W ndee, waɗta ɗum pufW ngam yahdude e innde huutorteende ngam taƴre gonnde e RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). Ko ɓuri haawnaade heen, ko poroteyiin-W ina tawee tan e fotde 10% e RC-LH1, ina feeñnina Rps. palustris ina feewna RC-LH1 ɗiɗi ceertuɗi. Ɗoo, eɗen ciftina mbaydiiji “cryo-EM” (cryo-EM) toowɗi e nder komplekseeji ɗiɗi gonɗi e nder ɓalndu, heen gooto ina waɗi poroteyiin W e 14 heterodimer αβ, goɗɗo oo alaa poroteyiin W e loowdi 16 Heterodimer LH1 udditiindi. Sifaa men ina hollita waylo-waylo weeyo e nder faamde RC-LH1 kompleks Rps. palustris, sabu en ƴeewtindiima keewal gootal e kala mbaydi, eɗen njogii resolution keewɗo ngam laaɓtinde kala peptide e pigmenteeji jokkondirɗi e lipiduuji e kinonuuji jokkondirɗi. Njiylawu ɗeen mbaydiiji ina hollita wonde poroteyiinuuji tati TMH-W ɗi tawaaka e kala kompleks RC-LH1 goɗɗo haa jooni ina peewna laawol kinon ngam yaawnude mbayliigu kinon/kinon. Nokkuuji keewɗi jokkondirɗi e lipid e kinon keɓtinaaɗi ina teskaa, min peeñninii waylo-waylo weeyo keso caggal nde kinon e RC kawri, ina waawi wonde ko moƴƴi e fotosistem II (PSII) RC e tagooje fototrofik oksijen. Ko min tawi koo ina addana en humpitooji kesi ko faati e kinetik jokkondire e mbayliigu kinon/kinon e nder RC-LH1 core complex bakteriiji fototrofik purpur.
Ngam weeɓtinde wiɗto laaɓtungo e komplekseeji ɗiɗi tawaaɗi e Rps. palustris, min ceernda kala RC-LH1 e laabi biyokimikaaji. Koolondiral poroteyiin W-deficient (hono no ΔpufW nii) laaɓtinaama e mbaydi ndi alaa ko woni e mum so wonaa taƴre pufW (16), ko koolaaɗo kuuɓal RC-LH1 gooto tan waawi feewnireede. Ko mbaydi gonndi e poroteyiin W- ina feewnee. Poroteyin W ooɗoo sifaa ina waylee e tagaaɗo 10x His to C-terminus mum, mbele kompleks gonɗo e poroteyiin W oo ina waawa hawrude e ko ɓuri heewde e poroteyiin W mo ŋakkaani, tawa ina ustoo njamndi. Koolaaɗo kuuɓal oo ina seerti no feewi (16) Kromatogaraafi affiniteer (IMAC).
No hollir-ɗen e Natal 1 nii, komplekseeji ɗiɗi ɗii fof ina njogii RC (RC-L, RC-M e RC-H) gonɗi e nder laylaytol tati, tawi ina taaroo antenaaji LH1. Sifaa 2.80-A mo kompleks mo alaa poroteyiin-W ina hollita 16 heterodimer αβ, ina waɗa loowdi LH1 udditiindi taariindi RC haa laaɓi, ndi wiyetee ɗoo ko kompleks RC-LH116. Ko 2,65 Å e mbaydi gonndi e poroteyiin-W ina jogii 14-heterodimer LH1 taƴaaɗo e poroteyiin-W, caggal ɗuum ko RC-LH114-W.
(A e B) Kollitgol dowri kompoññe. (C e D) Pigmentuuji jokkondirɗi kollitooji e ɓoggi. (E e F) Komplekseeji yiytaaɗi gila e dow sitoplasma ina njogii peptideeji e ɓuuɓri LH1 peeñɗi e karte, ina limtee e waktuuji gila e ŋorol protein-W [ina yahdi e limto Rba. sferoideeji (13)]. Wonande LH1-α, mbaydi ɓuuɓri poroteyiin ndii ko oole ; wonande LH1-β, mbaydi ɓuuɓri poroteyiin ndii ko bulo ; wonande poroteyiin-W, poroteyiin oo ko boɗeejo ; wonande RC-H, ko siyan; wonande RC-L, ko Oraas ; wonande RC-M, ko ɓaleejo. Kofaktoruuji ɗii ko ɓoggi, ɓaleeji ɗii ko molekule BChl e BPh a, boɗeeji ɗii ko karotenoid en, ɓaleeji ɗii ko molekule UQ10. (G e H) Yiyngo mawngo e luggere poroteyiin-W e nder nokku potɗo e RC-LH114-W (G) e RC-LH116 (H). Kofaktoruuji ina kollitee e mbaadi hebbingol nokku, kinon kelaat ina kollitee e bulo. Gagga poroteyiin-W oo ina teskaa e doggol danewol to (G), e ɓulli tokoosi ɗo kinon/kinolol diƴƴata e dow cirƴam LH116 ina teskaa e doggol ɓalewol to (H).
Natal 1 (A e B) hollitii RC ina taaroo mbaydiiji udditiiɗi walla udditiiɗi ɗi heterodimereeji LH1αβ, heen gooto fof ina jokkondiri e BChl ɗiɗi e karotenoid gooto (Natal 1, C e D). Wiɗtooji ɓennuɗi kollitii wonde Rps ko kompleks LH1. E nder laawol biyosintesis spirulina xanthin, ɗeeɗoo geɗe ina njogii mbaydiiji karotenoid jillondirɗi (17). Kono tan, ko spiropirroksantin woni karotenoid ɓurɗo heewde, tee ɓuuɓri mum ina weltina. Ko ɗum waɗi min cuɓii ko ƴettude spiroxanthin e denndaangal nokkuuji jokkondirɗe LH1. Polipeptideeji alfa e beta ko TMH gooto, jogiiɗo nokkuuji yaajɗi membraneeji juutɗi (Natal 1, A, B, E, e F). Hay so tawii densité 17 heddiiɓe e C-terminus yiytaaka, polipeptiid alfa oo ina seerti e Met1 haa Ala46 e nder komplekseeji ɗiɗi ɗii kala. Polipeptiid β ustaama gila e Gly4 haa e Tyr52 e nder RC-LH116, e gila e Ser5 haa e Tyr52 e nder RC-LH114-W. Alaa densité 3 walla 4 N-terminal walla 13 C-terminal heddii (Natal S1). Njiylawu spektorometri masse e kompleks RC-LH1 jillondirɗo peewnaaɗo e mbaydi ladde hollitii wonde nokku mo ŋakki oo ko batte ɓuuɓri heterologous ɗiin peptideeji (Natal S1 e S2). Formilaasiyoŋ N-terminal α-Met1 kadi yiytaa (f). Njiylawu oo hollitii wonde α-peptiid ina waɗi heddiiɓe fMet1 haa Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, β-peptiid ina waɗi heddiiɓe Ser2 haa Ala53, ko ɗum nanndi e kartal densité EM lowre nguleeki.
Koolondiral α-His29 e β-His36 ina addana BChls yeeso e yeeso ; kala heterodimer αβ ina hawra e hoɗdiiɓe mum ngam waɗde loocol udditiingol (RC-LH114-W) walla loocol udditiingol (RC-LH116) e saraaji RC Ko mbaydi pigment jokkondirndi e eksitoŋ (Natal 1, C e D). So en tuugniima e bannge 877 nm RC-LH114-W, 880 nm mbaydi boɗeeri ɓuuɓndi RC-LH116 ko 3 nm (Natal 2A). Kono tan, mbaydi dichroism cirkulaar ina fotnoo wonde gootum (Natal 2B), ko ɗum hollirta wonde hay so tawii ina woodi seerndi laaɓtundi hakkunde loope udditiiɗe e loope udditiiɗe, nokkuuji nokkuuji BChls ina nanndi no feewi. Redshift absorption ina waawi wonde sabaabu ustaare dille nguleeki e ɓeydagol darnde e dow loocol udditiingol (18, 19), waylo-waylo weeyo ngo loocol udditiingol ngol saabi (20, 21), walla jillondiral ɗee batte ɗiɗi (11).
(A) Ƴeekirgal ɓuuɓngal ultraviolet/yiyteteengal/ ɓadiiɗo-infrared, ɓuuɓol ngol ina maantiniree pigmenteeji mum nannduɗi e mum, ina normalisee e ɓuuɓol BPh to 775 nm. (B) Ƴeekirgal dikroism cirkowal noddaangal e ɓuuɓri BChl e 805 nm. (C e D) Ƴeewirde ΔA cuɓaande e nder ƴoƴre absorption ƴeewndotoonde sahaa e nder RC-LH114-W (C) e RC-LH116 (D). Ngam ɓurde nanndinde, denndaangal mbaydiiji ɗii ina njuutee e ∆A mo −A e 0,2 ps. (E) Njaajeendi oksidaasiyoŋ sitokrom c2 caggal nde ɓuuɓnaa e gonndigal UQ2 ceertungal (ƴeew natal S8 ngam humpitaade ko laaɓti). (F) E nder ƴiye mawɗe e les lewru ɓuuɓndu, hakkundeeru walla toowndu (10, 30 walla 300μMm-2 s-1, no mbaydiiji ɗii fof), ɓuuɓri poroteyiin W e RC-L e nder ɓuuɓri laaɓtundi e ɓuuɓri membrane seertundi. Anndinde tolno poroteyiin oo e elektoroforesis gel SDS-poliakrilamid e immunoassay (ƴeew natal S9 ngam humpitaade ko laaɓti). Anndinde njuuteendi ko yowitii e kompleks RC-LH114-W laaɓtuɗo. Resorde stoikiyometrik RC-L e poroteyiin-W e nder kompleks oo ko 1:1.
BChls gonɗi e nokku 1 e nder loowdi αβ14 RC-LH114-W (Natal 1, A, C, e E) ɓuri ɓadaade dokkoowo RC gadano (P) e 6,8 Å e BChls nannduɗi e RC-LH116 (Natal 1, B, D, D); kono tan, kinetik absorption transient e nder komplekseeji ɗiɗi ɗii ina hollita wonde wonande RC-LH114-W e RC-LH116, waktuuji mbayliigu semmbe ɓuuɓgol gila LH1 haa RC ko 40 ±4 e 44±3 ps (Natal 2). , C e D, Natal S4 e alluwal S2). Kadi alaa ko seerndi mbayliigu elektoronik nder RC (Natal S5 e binndol ɓeydotoongol jowitiingol heen). Eɗen cikki ko nanndi e sahaa mbayliigu semmbe hakkunde LH1 e RC-P, ko sabu nanndugol woɗɗude, njuuteendi e semmbe potɗo wonde ko ɓuri heewde e BChl e nder loope LH1 ɗiɗi ɗee. Ina wayi no yiylaade mbaadi semmbe LH1 ngam yettaade ɗo ɓuri famɗude ɗoo, ɓuraani yaawde e ƴellitde semmbe toowɗo ummoraade e nokkuuji ɓurɗi moƴƴude haa e RC. Loop LH1 udditirɗo e nder RC-LH114-W ina waawi kadi waɗde dille nguleeki ɗe ngalaa nafoore e nder ngonkaaji nguleeki les ngam yuurnitaade mbaydi, kadi ina woodi mbaydi αβ14 ɓurndi juutde e nguleeki suudu gila e woɗɗude pigmentation βBChls to nokku RC 1.
Koolaaɗo kuuɓal RC-LH116 ina waɗi 32 BChl e 16 karotenoid, e yuɓɓo mum fof ko gootum e yuɓɓo keɓaaɗo e pidpidum (Banque de données proteiques (PDB) ID 5Y5S (9), tiorhodovibriyo ID9T9r. (12) e ƴiye daneeje (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Caggal nde liggortoo, ko mbayliigaaji tokoosi tan njiytaa e nokkuuji heterodimereeji αβ, haa teeŋti noon e 1-5, 15, e 16 (Natal S6). Heɓde poroteyiin-W ina jogii batte keewɗe e mbaydi LH1. TMH maggal tati ina njokkondiri e loope juutɗe, tawa N-terminal ina woni e bannge lumen kompleks oo, C-terminal ina woni e bannge sitoplasma (Natal 1A e 3, A haa D). Poroteyin-W ɓuri heewde ko ɓuuɓɗo (Natal 3B), TMH2 e TMH3 ina njokkondiri e LH1αβ-14 ngam waɗde ɓalndu ɓuuɓndu (Natal 3, B e E haa G). Ko ɓuri heewde e hakkundeere ndee ko heddiiɓe e Phe, Leu e Val e nder diiwaan transmembrane. Ɗeen heddiiɗe ina njuɓɓinee e asideeji aminooji ɓuuɓɗi e pigmentaaji αβ-14. Won e heddiiɓe e polaar ina mballita kadi e jokkondire ɗee, ina jeyaa heen jokkondire hidrogen hakkunde W-Thr68 e β-Trp42 e dow ɗaɗol ɓuuɓol ngol (Natal 3, F e G). E dow ɓalndu sitoplasma, Gln34 ina ɓadii fedde keto karotenoid αβ-14. Yanti heen, n-dodesil β-d-maltoside (β-DDM) ɓuuɓnaama, wutte mum ɓuuɓɗo ina yaaji haa yettoo hakkunde poroteyiin-W e αβ-14, wutte lipid ina waawi wonde e nder ɓanndu. En teskiima kadi wonde nokkuuji resolution C-terminal ɗi poroteyiin W e RCH ina ɓadii no feewi, kono ngonaa e nder mbaadi peewnugol jokkondire keertiiɗe (Natal 1, A e E). Kono tan, ina waawi tawa ina woodi jokkondire e nder asideeji amino C-terminal ɗi ƴeewtaaka ɗiin poroteyiinuuji ɗiɗi, baawɗi rokkude feere ngam ƴellitde poroteyiin-W e nder mooɓondiral RC-LH114-W.
(A) Poroteyin-W, gonɗo yeeso hakkunde LH1αβ14 e mbaadi kartoŋaaji, ina jogii jokkere enɗam (boɗeere), hollirnde e nder feccere e natal pottital elektorostatik (surface grey transparent e tolno kontur 0,13). (B) Poroteyin-W holliraaɗo e dow mbaydi colour hydrophobe. Nokkuuji polaar e charge ina kollitee e mbaydi siyan, nokkuuji ɗi njiyataa ndiyam ina kollitee e daneejo, nokkuuji ɗi njiyataa ndiyam no feewi ina kollitee e oraas. (C e D) Poroteyin-W holliraaɗo e kartoŋaaji, njuuteendi mum ko noon woniri e (A) (C), ina yirloo 180° (D). E fawaade e ngonka e nder doggol ngol, heddiiɓe e ceertuɓe ɓee ina njogii mbaydi mbaylaandi, ɗo N-terminal woni bulo, C-terminal woni boɗeejo. (E) Poroteyin-W e yiyngo ngootiri hono no (A) nii, e heddiiɓe e jokkorgal poroteyiin-W:LH1 ina kolliree ɓoggi jogiiɗi maandeeji jokkondirɗi. (F) Protein-W ina yirloo 90° fawaade e (E) e LH1αβ14 e nder mbaydi kartoŋaaji, e fawaade e heddiiɓe e hakkundeeji e nder mbaydi bar. Heddiiɓe e dow polipeptiid beta ina mbiyaa. Kofaktor oo hollirtee ko no barme nannduɗo e mbaydi Natal 1, β-DDM ɓuuɓɗo oo hollirtee ko e mbaydi ɓaleeri, oksijen oo hollirtee ko e mbaydi boɗeeri. (G) Yiyngo ngo (F) ina yirloo 180°, tawa ina waɗi heddiiɓe e polipeptiid alfa mo limtaa oo.
Poroteyin-W lomtotoo ko heterodimer αβ (15ɓo e Natal 1F), ɗum noon ina haɗa uddugol loowdi e ɓuuɓnude heterodimer αβ tati gadani ɗii. Teskaama wonde njuuteendi njuuteendi ɓurndi mawnude e njuuteendi njuuteendi heterodimer αβ-1 gadano oo e njuuteendi njuuteendi filmo oo ko 25° haa 29° (Natal 1, A e E), ko ɗum waɗi njuuteendi njuuteendi 2° haa 8° αβ-1 e nder RC A sharp contrast-LH116 (Natal 1, B). Heterodimereeji ɗiɗaɓi e tataɓi ɗii ina njuuti e 12° haa 22° e 5° haa 10°. Sabu caɗeele sterik RC, tilde αβ-1 ndee hawraani e αβ ɗiɗaɓo oo (ko nanndi e αβ 16ɓo e Natal 1F), ɗum noon ina waɗa ɓuuɓri laaɓtundi e nder cirƴam LH1 (Natal 1, A e E) . Sabu ŋakkeende heterodimereeji ɗiɗi αβ, wondude e majjugol BChl nay e karotenoiduuji ɗiɗi, hay gooto e karotenoiduuji ɗii jokkondirtaa e ɓuuɓri αβ-1 ɓuuɓndi, ɗum noon ina addana cirƴam LH114-W ina waɗi karotenoiduuji 13 Vegetarian e 28 BChls. Hiisaaji resolution nokkuuji ɗi komplekseeji ɗiɗi ɗii e nder diiwanuuji αβ1 haa 7 ina pamɗi e heddiiɓe e loowdi LH1, ina waawi hollude plastisite gonɗo e nder lowre LH1 jokkondirnde e nokku RC QB (Natal 4) .
Nate RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) kolliraama gila e yiyngo dow/bannge gooto (A e B) (A e C) e dow ŋoral Fig. 1. (B e D). Kuutorɗe colour ɗee kolliraama to bannge ñaamo.
Koolaaɗo kuuɓal sifaa goɗɗo tan, mo njuuteendi mum tolnii e 1:14, ko dimer RC-LH1-PufX (13). Kono tan, poroteyiin W e PufX ngalaa homoloji laaɓtuɗi, ina njogii batte keewɗe e mbaydiiji mum en LH1. PufX ko TMH gooto jogiiɗo domen sitoplasma N-terminal jokkondirɗo e bannge sitoplasma gonɗo e ɓuuɓri RC-H (13) e nokku potɗo e Rps. ɓuuɓri LH116αβ-16. PufX ina sosa laawol ngam waylude kinon/kinon hakkunde RC-LH1 e kompleks sitokrom bcl, ina tawee e Rba fof. sferoideeji gonɗi e nder ɓalndu (13). Hay so tawii noon jokkorgal monomer-monomer woni ko e Rba. Dimer sfaeroid RC-LH1-PufX ina woni e nokku jokkondirɗo e poroteyiin W e nder RC-LH114-W, kadi gap mo PufX e poroteyiin-W ngaddata oo ina woni e nokku potɗo (Natal S7A). Gagga oo e nder RC-LH114-W ina yahdi kadi e laawol kinon (8) gonngol e Pseudomonas rosea LH1, ngol peptideeji ɗi ngonaa jokkondirɗi e poroteyiin W walla PufX (Natal S7B) mbaɗata. Yanti heen, kanndaa kinon e nder Blc. LH1 ɓaleejo emerald mo sosaa e ittude γ gooto (7) ina woni e nokku nannduɗo e oo (Natal S7C). Hay so tawii ko poroteyiinuuji ceertuɗi njiylotoo ɗum, feeñde ɗeen laabi kinon/kinolol e nder nokku gooto e nder njuɓɓudi RC-LH1 ina wayi no ko yeru ƴellitaare kawrital, ko ɗum hollirta wonde gap mo poroteyiin W tagi oo ina waawi wonde laabi kinon.
Gaaci gonɗi e nder loowdi LH114-W ina addana en waɗde nokku membrane jokkondirɗo hakkunde nokku ndernderiijo RC-LH114-W e membrane bulk (Natal 1G), wonaa jokkondirde domenaaji ɗiɗi ɗii rewrude e pore poroteyiin hono no poroteyiin nii. Koolaaɗo kuuɓal RC-LH116 ina nanndi e Tch udditirɗo. Kompleks nannduɗo e ƴiye (22) (Natal 1H). Nde tawnoo diƴƴe kinon e nder memtinal ɓuri yaawde e diƴƴe rewrude e laawol poroteyiin ɓuuɓngol, loowdi LH114-W udditiindi ina waawi addande RC mbayliigu ɓurngu yaawde e loowdi LH116 udditiindi, kadi diƴƴe kinon e nder RC ina waawi ɓurde famɗude. Ngam ƴeewde so tawii poroteyiin W ina waawi battinde e waylude kinonuuji rewrude e RC, min mbaɗii ƴeewndo oksidaasiyoŋ sitokrom e dow won e ɓuuɓri ubikinon 2 (UQ2) (analog UQ10 naftowal mo wutte isopren ɓurɗo juutde) (Natal 2E). Hay so tawii noon woodde kinon kelaat ina haɗa anndude no feewi mbaydi Michaelis nanndundi (RC-LH114-W e RC-LH116 ina moƴƴi e 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM, no mbaydiiji ɗii fof), tolno ɓurɗo mawnude e RC-LH1.2.RC114-1 28±5% ɓuri RC-LH116 mawnude (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
En limtii e fuɗɗoode wonde poroteyiin-W ina tawee e fotde 10% e ɓuuɓri ƴiiƴam (16); ɗoo, keeweendi occupation e nder ƴiye mawɗe ɗe lewru famɗi, hakkunde lewru, e lewru toowndu ko 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5 % (Natal 2F). Njiylawu keewal spektorometri masse hollitii wonde ɓeydagol tag histidine ustaani keeweendi poroteyiin-W so yerondiraama e mbaydiiji laddeeji (P = 0,59), ɗum noon ɗeen toɓɓe ngonaa artifaks poroteyiin-W moɗtuɗo (Natal S10). Kono tan, ngool ŋakkeende jogaade poroteyiin-W e nder njuɓɓudi RC-LH1 ina waawi addande won e RC-ji ɓuuɓde e njaaweeki, ɗum noon ina usta mbayliigu kinon/kinolon ɓurngu leeltude e nder njuɓɓudi RC-LH116. En teskiima wonde keeweendi annoore toownde ina luurdi e doosɗe transkriptomik cakkitiiɗe ɗee, ko ɗum hollirta wonde baylagol taƴe pufW ina ɓeydoo e les annoore tiiɗnde (Natal S11) (23). Ceertugol baylagol pufW e naatgol poroteyiin-W e nder RC-LH1 ina jiiɓii, ina waawi kadi hollirde njuɓɓudi kuuɓtodinndi poroteyiin oo.
E nder RC-LH114-W, 6 kardiyolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) e 29 molekule β-DDM ina ndokkee, ina mooftee e nder mum 6 CDL, 24 POPC, 2 POβDM e 12. RC-LH116 (Natal 5, A e B). E nder ɗeeɗoo mbaydiiji ɗiɗi, CDL ina fotnoo wonde e bannge sitoplasma e nder kompleks oo, tawi noon POPC, POPG e β-DDM ɓuri wonde ko e bannge luminal. Molekule ɗiɗi lipid e detergen peeñninaama e nokku αβ-1 haa αβ-6 e nder kompleks RC-LH114-W (Natal 5A), joy peeñninaama e nokku nannduɗo e RC-LH116 (Natal 5B ). Lipiduuji ɓurɗi heewde ina tawee e bannge goɗɗo oo e kompleks oo, ko ɓuri heewde ko CDL, mooftaaɗi hakkunde RC e αβ-7 haa αβ-13 (Natal 5, A e B). Lipiduuji e detergentuuji goɗɗi peewnaaɗi e mbaydiiji ina tawee e yaasi cirƴam LH1, e caɗeele asil peewnaaɗe no moƴƴi ina njaaji hakkunde ɓuuɓri LH1, tawa ina toɗɗii β-DDM e nder RC-LH114-W, ina siforee β-DDM e nder RC A jillondiral βPOPC-DHDM e 166. Darnde nanndunde e lipiduuji e detergentuuji chelating e nder mbaydi men ina kollita wonde ko nokkuuji jokkondirɗi jowitiiɗi e fijirde (Natal S12A). Darnde moolanaaɗe nannduɗe e Tch kadi ina njogii jokkondire moƴƴe. Neɗɗaŋke e Trv. Sokla 970 RC-LH1s (Natal S12, B haa E) (9, 12) e heddiiɓe e jokkondire hidrogen e nder fedde hoore lipid hollirii no feewi reentaare moƴƴere e nder njuɓɓudi jokkondire (Natal S13), ko ɗum hollirta wonde CDL reentaare jokkondirnde e RC (24), ɗeen nokkuuje ina mbaawi wonde reentaare e nder compHDLx-.
(A e B) Peptideeji RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) ina kolliree karte, pigmenteeji ɗii kolliraa ko ɓoggi, kuutortooɗi mbaydi colour e Natal 1. Lipiduuji ɗii kolliraama e boɗewol, detergenuuji ɗii kolliraama e boɗeeji. UQ jokkondirɗo e nokkuuji RC QA e QB ko oole, UQ mo seerti e mum ko bulo. (C e D) Yiyngooji gooti e (A) e (B), lipiduuji ɗii ngoppaama. (E haa G) Yiyngo mawngo Q1(E), Q2(F) e Q3(G) ummoraade e RC-LH116, tawa ina waɗi caɗeele banngeeji baɗɗiiɗi. Jokkondire hidrogen ɗee kolliraama no laabi ɓaleeji gonɗi e ŋorol.
E nder RC-LH116, RC QA e QB UQ fof, tawtoraaɓe e mbayliigu elektoronik e nder golle seerndude njamndi, ina njuumta e nokkuuji mum en jokkondirɗi. Kono e RC-LH114-W, kinon QB ƴeewtaaka, maa en kaal heen no feewi les ɗoo. Ko jiidaa e kinonuuji QA e QB, molekule UQ ɗiɗi (goɗɗe hakkunde cirƴam RC e LH1) ina pecciraa e nder mbaydi RC-LH114-W fawaade e pelle hoore mum en laaɓtuɗe (goɗɗe e Q1 e Q2, no mbaydiiji ɗii fof). asama). Natal 5C). Yuɓɓooji isoprene ɗiɗi ina ndokkee e Q1, kartal densité ina safra wutteeji isoprene 10 timmuɗi ɗi Q2. E nder mbaydi RC-LH116, molekule UQ10 tati (Q1 haa Q3, Natal 5D) njuɓɓinaama, molekule ɗee kala ina njogii ɓuuɓri laaɓtundi e nder wutte oo fof (Natal 5, D haa G). E nder mbaydiiji ɗiɗi ɗii, nokkuuji pelle hoore kinooje Q1 e Q2 ina njogii jokkondire moƴƴe (Natal S12F), tee ina njokkondiri tan e RC. Q1 woni ko e damal gap W RC-LH114-W (Natal 1G e 5, C, D e E), Q2 woni ko sara nokku jokkondirɗo QB (Natal 5, C, D) e F). Heddiiɓe e L-Trp143 e L-Trp269 keɓtinaaɗi ɗii ina ɓadii no feewi Q1 e Q2, ina ndokka jokkondire π-stacking potɗe waɗeede (Natal 5, E e F, e Natal S12). L-Gln88, 3,0 Å ummoraade e oksijen distal Q1, ina rokka jokkondire hidrojen tiiɗɗe (Natal 5E); ndeeɗoo heddiinde ina reeni e RC en fof so wonaa jokkondire ɓurɗe woɗɗude (Natal S13). L-Ser91 ina lomtoo Thr e ko ɓuri heewde e RCs goɗɗi ɗii (Natal S13), ko 3,8 Angstrom ummoraade e oksijen metil Q1, ina waawi kadi rokkude jokkondire hidrojen ɗe ngalaa semmbe (Natal 5E). Q3 wayi ko no alaa ko jokkondiri e mum, kono ina woni e nokku mo ndiyam ɓuuɓɗam woni hakkunde ɓuuɓri RC-M e ɓuuɓri LH1-α 5 haa 6 (Natal 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 walla kinoneeji kelaaɗi ɓadtiiɗi ɗii kadi njuurnitaama e Tch. Neɗɗaŋke, Trv. Sokla 970 e Blc. Sifaa iris (9, 10, 12) ina hollita nokku ɗo kinonuuji ballitooji jokkondirta e nder njuɓɓudi RC-LH1 (Natal S12G). UQs joy gonɗi e RC-LH116 ina kawri no feewi e 5,8±0,7 e kala kompleks mo nganndu-ɗaa ko kañum woni ko wiyetee « kromatogaraafi ndiyam toowɗo » (HPLC), tawi UQs tati gonɗi e RC-LH114-W ɗii ina pamɗi e Nafoore fotnde e 6,2±0,3 ina hollita wonde S1 suudu.
Polipeptideeji L e M pseudo-symétriques ɗii, heen gooto fof ina waɗi TMH joy, ina waɗi heterodimer gooto, ina hawra e dimer gooto BChl, monomereeji ɗiɗi BChl, monomereeji ɗiɗi bakteriyofaaji (BPh), e njamndi wootiri ndi wonaa Heme e molekul UQ10 gooto walla ɗiɗi. Rewrude e woodgol jokkondire hidrojen e dow fedde keton timmunde e mooɓondiral mum anndaangal e nder Rps, karotenoid ina naata e nder feccere M, nde inniraa cis-3,4-dehydroorhodopin. Muuñal (25). Domen membrane yaajɗo RC-H ina jokkondiri e membrane oo e TMH gooto. Ko heewi e mbaydi RC ina nanndi e mbaydiiji tati RC gonɗi e mbaydiiji jokkondirɗi (hono Rba). sfeerooji (ID PDB: 3I4D). Makrosiklooji BChl e BPh, ɓalndu karotenoid e njamndi ndi wonaa heme ina kawri e nder njuuteendi resolution ɗiin mbaydiiji, hono no fedde hoore UQ10 to nokku QA e kinon QB to RC-LH116 (Natal S15).
Heɓde mbaydiiji ɗiɗi RC jogiiɗi tolnooji keewɗi e nokkuuji QB ina rokka fartaŋŋe keso ngam ƴeewtaade mbayliigaaji konformaasiyoŋ jokkondirɗi e jokkondire kinon QB. E nder kompleks RC-LH116, kinon QB ina tawee e nokku “proksimal” timmuɗo (26), kono seerndude RC-LH114-W alaa kinon QB. Alaa kinon QB e nder RC-LH114-W, ko ɗum huunde haawniinde sibu kompleks oo ina golloo, ɓuri kompleks RC-LH116 mo ​​kinon QB mo mbaydi mum laaɓtundi. Hay so tawii cirƴe ɗiɗi LH1 ɗee ina ceerti fotde kinonuuji jeegom, joy ina njuɓɓinee e nder cirƴam RC-LH116 udditiiɗam, tawi ko tati tan ina keewi e cirƴam RC-LH114-W udditiɗam . Ndeeɗoo ŋakkeende mbaydi ɓeydotoonde ina waawi hollude lomtingol nokkuuji RC-LH114-W QB ɓurɗi yaawde, kinetik kinonuuji ɓurɗi yaawde e nder kompleks oo, e ɓeydagol waawde taƴde loowdi LH1. Eɗen cikki wonde ŋakkeende UQ e nokku RC QB mo RC-LH114-W ina waawi wonde sabaabu ɓurɗo saɗtude e ɓurɗo waawde golloraade, kadi nokku QB mo RC-LH114-W ina ɓuuɓna ɗoon e ɗoon e nder mbayliigu UQ Daawe keertiiɗe (naatgol nokku QB ina udditaa e ndee conformation ref.
So QB alaa, yirlaade L-Phe217 e nokku mo yahdaani e jokkondire UQ10, sibu maa ɗum addan jolngo nokkuyankeewo e yuɓɓo isoprene gadano wutte oo (Natal 6A). Yanti heen, mbayliigaaji konformaasiyoŋ mawɗi laaɓtuɗi ɗii ina laaɓti, haa teeŋti noon e helix de (helix juutɗo e nder loowdi hakkunde TMH D e E) ɗo L-Phe217 ustata e poos jokkondirɗo QB e yirlaade L-Tyr223 (Natal 6A ) Ngam taƴde jokkondiral hidrogen e kaɓirgal jokkondirngal QB e M-4 nokku (Natal 6B). Helix de pivots e dow mum, Cα L-Ser209 ina ɓuuɓtoo fotde 0,33Å, L-Val221Cα ina ɓuuɓtoo fotde 3,52Å. Alaa waylooji njiylotooɗi e TMH D e E, ɗi njiylotoo ko e nder mbaydiiji ɗiɗi ɗii kala (Natal 6A). Ko nganndu-ɗen, ko ɗum woni mbaydi adanndi e nder RC naftowal udditirde nokku QB. Njiylawu e mbaydi timmundi (QB-bound) ina hollita wonde hade kinooje ustaade, mbayliigu konformaasiyoŋ ina ɗaɓɓi ngam waɗde ɗum naatde e kinooje. L-Phe217 ina yirloo ngam waɗde jokkondire π-stacking e fedde hoore kinone, helmere ndee ina wayloo feewde yaasi, ina addana ƴiye L-Gly222 e cakkital bannge L-Tyr223 waɗde jokkondire hidrogen jogiiɗe mbaydi jokkondire hidrogen dariinde (Natal 6, A e C).
(A) Kartoŋaaji gonɗi e dow hologram (cakkital L, cakkital oraas/M, magenta) e mbaydi apo (gray), ɗo heddiiɓe e keyɗe ɗee kollirtee e mbaadi mbaydi nanndundi e sawru. UQ10 ina hollira barme oole. Laral toɓɓere ngal hollirta ko jokkondire hidrogen peeñɗe e nder mbaydi ndii fof. (B e C) Ko hollirta dow apolipoprotein e denndaangal mbaydi cirƴam, teeŋtinirɗi oksijen cakkital bannge L-Phe217 e bulo e L-Tyr223 e boɗeejo, no mbaydiiji ɗii fof. Subunit L ko oraas; ɓuuɓri M e H ndi alaa ko woni e mum. (D e E) Nokkuuji RC QB apolipoprotein (D) e denndaangal (E) [color e (A)] e Termofilus termofilus PSII (haako-ñebbe, daneejo e kinon palastik; ID PDB: 3WU2) Liggoraade (58).
Ko sikkanooka, hay so tawii mbaydiiji keewɗi RCs ŋakkuɗi QB tawa LH1 ina ngoodi, mbayliigaaji konformaasiyoŋ teskaaɗi e ndeeɗoo wiɗto, ko adii ɗuum, kollitaaka. Ina jeyaa e ɗeen, mbaydi ŋakkeende QB ummoraade e Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (28) e Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), ɗiin fof ina ɓadii gootum e mbaydi mum en QB kuuɓtodinndi. Ƴeewndo ɓadiiɗo 3PRC hollitii wonde molekule detergen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ina njokkondiri e damal nokku QB, ɗuum ina waawi haɗde yuɓɓinde e nder mbaydi udditiindi. Hay so tawii LDAO ustataako e nokku gooto e nder 1EYS walla 1OGV, ɗeen RC ina peewniree huutoraade detergen gooto, ɗum noon ina waawi waɗde batte goote. Ko mbaydi kiriis Rba. Sphaeroides RC mo kiristaal mum wondi e sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) ina wayi no ina jogii kadi nokku QB udditirɗo. Kono e oon sahaa, nokku N-terminal polipeptiid RC-M (jokkondirɗo e nokku jokkondirɗo QB rewrude e jokkondiral H heddiiɓe e Tyr e dow helmere Q) ina ƴetta mbaydi ndi wonaa nafoore, tee waylo mbaydi QB ndi ɓeydaaka ƴeewteede (30 ). Ko ɓuri welde heen ko en njiyaani ooɗoo sifaa mbayliigu polipeptiid M e nder mbaydi RC-LH114-W, ko famɗi fof ko nanndi e nokku N-terminal RC-LH116 RC. Ina foti teskeede kadi wonde caggal nde antena LH1 baɗaaɗo e detergen momtaa, RCs apolipoprotein e nder PDB ɗee njuɓɓinaama, ɗum noon ina itta poolguuji kinon ndernderiiji e lipiduuji e nder ŋoral hakkunde RC e dow ŋoral ndernderiwal cirƴam LH1 taariindi (31, 32). RC ina heddii e golle sabu ina jogii kofaktooruuji ɗii fof, so wonaa kinon QB mo ɓuuɓnataa, mo alaa ɗo haaɗi, mo heewi majjude e nder golle peewnugol (33). Yanti heen, ina anndaa wonde ittugol LH1 e lipiduuji cirkooji naftooji e RC ina waawi addude batte e golle, ko wayi no juutde nguurndam P+QB-state ceertuɗo e charge (31, 34, 35). Ko ɗum waɗi eɗen cikki wonde woodgol cirƴam LH1 nokkuyankeewal taarotoongal RC ina waawi jogaade nokku QB “udditiiɗo” oo, tawa ina hisna nokkuyankeewo sara QB oo.
Hay so tawii apolipoprotein (mo alaa kinon QB) e mbaydi mum timmundi ina mbaɗi tan ko nate ɗiɗi gonɗe e mbayliigu nokku QB, wonaa tan e mbaydiiji kewuuji, ina woodi ko holliti wonde jokkondire ɗee ina mbaawi gaɗeede ngam haɗde jokkondire ɗee e hidrokinon Ngam haɗde jokkondire substrat. Jokkondiral kinolol e kinon sara nokku QB apolipoprotein ina waawi seertude, ko ɗum addanta RC jaɓde ɗum. Ko ɓooyi miijaade wonde waylooji konformaasiyoŋ ina njogii darnde e jokkondire e ustude kinonuuji. Baawgol RCs ɓuuɓɗi ustude kinonuuji caggal nde njiyti niɓɓere ina famɗi (36); Kiristalogaraafi ranwiiji ina hollita wonde ngool bonngol ina addana kinonuuji QB gonɗi e nder mbaydi “distal” fotde 4,5 Å ummoraade e nokku ɓadiiɗo (26) , 37). Eɗen cikki wonde ngool mbaydi jokkondire distal ko ƴeewndo ngonka hakkunde apolipoprotein e mbaydi cirƴal timmungal, rewrude e jokkondiral gadanal e kinon e udditgol nokku QB.
RC mo sifaa II tawaa e nder kompleks PSII won e bakteriiji fototrofik e bakteriiji siyano, alkule e leɗɗe ina jogii ndeenka mbaydi e golle (38). Koolondiral gonngal e Natal 6 (D e E) ina teeŋtina nanondiral hakkunde RCs PSII e nokku QB mo kompleks RC bakteriiji. Ndeeɗoo nanondiral ɓooyii wonde mbaydi ngam janngude mbaydiiji jokkondirɗe e ustaare kinon. Binndanɗe ɓennuɗe kollitii wonde waylooji konformaasiyoŋ ina njahda e ustaare PSII e kinonuuji (39, 40). Ko ɗum waɗi, so en teskiima reentaade RC e ƴellitaare, ngool laawol jokkondire ngol yiytaaka tawo ina waawi kadi huutoreede e nokku QB PSII RC e nder leɗɗe fototrofik oksijen.
Rps ΔpufW (moƴƴere pufW nde alaa maande) e PufW-His (poroteyiin-W mo alaa maande C-terminaal 10x His holliraaɗo e nokku pufW naftowal) mbaydiiji. palustris CGA009 ina siforee e golle men ɓennuɗe (16). Ɗeeɗoo mbaydiiji e jibinannde ladde isogenic keɓtinaama e nder congelateur e ɓuuɓnude limre seeɗa e dow PYE (kala 5 g liiteer -1) (moƴƴinaaɗo e LB to -80 °C, ina waɗi 50% ( w/v) gliserol) poroteyiin, ƴiiƴam lewru e suksinat (% suksinat) pla.v agar [15]. Lefol ngol ina ɓuuɓna jamma e nder niɓɓere e nguleeki suudu e nder ngonkaaji anaerobiik, caggal ɗuum ina yaynaa e annoore daneere (~50 μmolm-2 s-1) nde lampaaji halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) ndokki balɗe 3 haa 5 haa nde koloñaal gootol feeñi. Koloni gooto huutoraa ngam ustude 10 ml e nder njuuteendi M22+ (41) ɓeydaaɗi e 0,1% (w/v) asid kasamino (ko ɗoo woni M22). Pinal ngal ina mawni e nder ngonkaaji oksijen tokoosi e nder niɓɓere to 34°C e diƴƴe 180 rpm fotde waktuuji 48, caggal ɗuum 70 ml pinal ngal ina ɓuuɓna e nder ngonkaaji gooti ɗii fotde waktuuji 24. Pinal semi-aerobiik mo njuuteendi mum tolnii e 1 ml ina huutoree ngam ustude 30 ml e nder ɓuuɓri M22 e nder 30 ml ɓuuɓri gilaas ɓuuɓndi, ndi ɓuuɓnaaka e ɓuuɓri (~50μmolm-2 s-1) fotde waktuuji 48 e doole magnetik sterile Stirring rod. Ndeen 30 ml e pinal ngal ina njuutee e fotde liiteer 1 pinal e nder ngonkaaji gooti ɗii, ndeen noon ina huutoree ngam ɓuuɓnude fotde 9 liiteer pinal ngal ina yaynaa e ~200 μmolm-2 s-1 fotde waktuuji 72. Ɓowɗi ɗii ƴettaa ko e ɓuuɓri 7132 RCF fotde hojomaaji 30, ɗi njuppaa e ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), ɗi ndewa e -20°C haa ɗi njiɗaa.
Caggal nde ɓuuɓtii, ɓeydee heen won e kiristaaluuji deoksiribonuklease I (Merck, Angalteer), lisozim (Merck, Angalteer) e taƴe ɗiɗi Roche holoenzim protease (Merck, Angalteer) e nder ƴiye ɓuuɓɗe ɗee. E nder ƴiiƴam Farayse 20 000 psi (Aminco, Amerik), ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaama laabi 8 haa 12. Caggal nde ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaaka e ƴiiƴam ɗam ɓuuɓnaaka e nder 18 500 RCF fotde hojomaaji 15 e 4°C, membrane oo ɓuuɓnaa e lisaat pigment oo e nder 113 000 RCF fotde waktuuji 2 e 43 000°C. Werlo feccere ɓuuɓnde ndee, ɓuuɓna ɓuuɓri ndii e nder 100 haa 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e homogenize haa alaa ko yiyata. Membraan ɓuuɓɗo oo, ɓuuɓnaama e tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, Amerik) tawa ina waɗi 2% (w/v) β-DDM fotde waktu gooto e nder niɓɓere to 4°C tawa ina ɓuuɓna ɗum no feewi. Ndeen centrifuge to 70°C ngam ɓuuɓnude 150 000 RCF e 4°C fotde waktu 1 ngam ittude heddiiɓe e ɓuuɓnude.
Membraan ɓuuɓnoowo ummoriiɗo e mbaydi ΔpufW oo, waɗaama e koloñaal mbayliigu iyon Sefarose DEAE 50 ml, tawa ina waɗi ɓuuɓri koloñaal tati (CV) tampon jokkondirɗo [20 mM tris-HCl (pH 8,0) ina waɗi 0,03% (w / v) β-DDM]. Loowde koloñaal oo e tamponuuji ɗiɗi jokkondirɗi CV, caggal ɗuum loowde koloñaal oo e tamponuuji ɗiɗi jokkondirɗi tawa ina waɗi 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 oo ɓuuɓnaama e mbaydi lineer 150 haa 300 mM NaCl (e nder tampon jokkondirɗo) e dow 1,75 CV, heddii ko ɓuuɓnaa e tampon jokkondirɗo ina waɗi 300 mM NaCl e dow 0,5 CV. Moftu mbaydi ɓuuɓndi hakkunde 250 e 1000 nm, jogo feccere nde njuuteendi mum (A880/A280) ɓuri 1 e 880 haa 280 nm, ɓuuɓna ɗum laabi ɗiɗi e nder tampon jokkondirɗo, huutoroo kadi ngool laawol e dow koloñaal DEAE On purification. Dillude pecce ɗe A880/A280 njuuteendi mum en ɓuri 1,7 e A880/A805 njuuteendi mum en ɓuri 3,0, mbaɗa mbayliigu iyon tataɓo, e jogaade pecce ɗe njuuteendi mum en A880/A280 ɓuri 2,2 e A880/A805 njuuteendi mum en ɓuri.0. Koolaaɗo kuuɓal laaɓɗo oo, ɓuuɓnaama haa ~2 ml e nder filtirde ɓuuɓnde Amicon 100 000 (MWCO) (Merck, Angalteer), ɓuuɓnaa e dow ɓuuɓol ɓuuɓngol Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) tawa ina waɗi 200 ml tampon NaM thelume e nder 200 m 1,5 CV. Moftu mbaydiiji mooftirɗi feccere ittugol mawneeki, e ɓuuɓnude mbaydiiji mooftirɗi ɗii e mbaydiiji A880/A280 dow 2,4 e mbaydiiji A880/A805 dow 5,8 haa 100 A880, e ɗoon e ɗoon huutoraade ɗi ngam feewnude walla mooftude grid cryo-TEM Keep at -til80.
Membraan ɓuuɓnoowo ummoriiɗo e mbaydi PufW-His oo, waɗaama e 20 ml e nder ɓuuɓri sefarose HisPrep FF Ni-NTA (20 mM tris-HCl (pH 8,0) ina waɗi 200 mM NaCl e 0,03% (w/w)) e nder tampon IMca ( GE). v) β-DDM]. Kolonel oo loowaama e CV joy tampon IMAC, caggal ɗuum e CV joy tampon IMAC ina waɗi histidine 10 mM. Kompleks core oo yaltinaama e koloñaal oo e tamponuuji joy IMAC baɗɗi histidin 100 mM. Feccere nde RC-LH114-W woni e mum ndee, ina ɓuuɓnee haa ~10 ml e nder lowre ɓuuɓnde, tawa ina waɗi filtirde Amicon 100 000 MWCO (Merck, UK), ina ɓuuɓnee laabi 20 e tampon jokkondirɗo, caggal ɗuum ina ɓeydee e 25 ml e nder tampon DEAE fo ko adii. Loowde koloñaal oo e tamponuuji jokkondirɗi CV nay, caggal ɗuum ɓuuɓna kompleks oo e dow CV-ji jeetati e dow ŋorol lineer 0 haa 100 mM NaCl (e nder tampon jokkondirɗo), e CV-ji nay keddiiɗi ɗii tawa ina njogii tampon jokkondirɗo 100 mM Komplekseeji keddiiɗi ɗii ɓuuɓnaama e dow A8de20 ko ɓuri 2,4 e njuuteendi A880/A805 ko ɓuri 4,6 pecce ɗee njuɓɓinaama haa ~2 ml e nder filtirde senngo Amicon 100 000 MWCO, e hebbinde 1,5 CV IMAC e yeeso Tampon ekilibre Superdex 200 si 1,5 CV. Moftu ƴulɓe ɓuuɓɗe pecce mawneeki-ɓuuɓɗe ɗee e ɓuuɓnude ƴulɓe ɓuuɓɗe ɗee e limtooji A880/A280 dow 2,1 e limtooji A880/A805 dow 4,6 haa 100 A880, ɗi kuutortee ɗoon e ɗoon ngam feewnude laylaytol TEM ɓuuɓngol walla defde haa -8°C.
Ko ɓuuɓri Leica EM GP huutoraa ngam feewnude jolɗe TEM ɗe nguleeki mum en famɗi. Kompleks oo ɓuuɓnaama e nder tampon IMAC haa A880 mo 50, caggal ɗuum 5μl ɓuuɓnaama e dow ɓuuɓol kesol QUANTIFOIL 1.2/1.3 ɓuuɓngol njamndi mboɗeeri (Agar Scientific, UK). Ƴeewee gris oo e 20°C e 60% nguleeki tolniiki e 30 s, caggal ɗuum ɓuuɓnee ɗum yoora fotde 3 s, caggal ɗuum ɓuuɓnee ɗum e etan ndiyam to -176°C.
Dowlaaji RC-LH114-W ɗii mbinndaa ko e eBIC (Centre bioimaging électronique) (Fuɗɗoode annoore diamant Angalteer) e mikroskoop Titan Krios, golloowo e semmbe jaawɗo 300kV, e semmbe nominaal Choose 130 000 gap of-2 e an Ko Gatan 968 GIF Quantum jogiiɗo detektoor toppitiiɗo K2 huutoraa ngam winndude natal e mbaadi limto ngam mooftude dokke. Njaajeendi piksel kalibraa ko 1,048Å, e tolno doosgal ko 3,83 e-Å-2s-1. Mofti filmo oo e nder leƴƴanɗe 11, fecci ɗum e 40 pecce. Huutoro nokku mo karbon ɓuuɓnata oo ngam ƴellitde mikroskoop oo, caggal ɗuum mooftu filmuuji tati e nder ɓuuɓri kala. E nder heen, 3130 filmo mooftaama, tawi teddeendi defocus ina woni hakkunde -1 e -3μm.
Doggi RC-LH116 ɗii mooftaama e kuutoragol mikroskoop gooto to Laboratuwaar Biyostruktuur Asterbury (Duɗal jaaɓi-haaɗtirde Leeds, Angalteer). Dowlaaji ɗii mooftaa ko e mbaadi limto e mawneeki 130 k, njaajeendi pixel oo kalibraama haa 1,065 Å e dose 4,6 e-Å-2s-1. Filma oo waɗi ko e leƴƴanɗe 12, feccii ko e 48 pecce. E nder ɗuum, 3359 filmo mooftaama, tawi teddeendi defocus ina woni hakkunde -1 e -3μm.
Denndaangal golle baɗaaɗe e doosɗe ina mbaɗee e nder laylaytol Relion 3.0 (42). Huutoro Motioncorr 2 (43) ngam feewnude dille bempeƴƴe ɗee e teddeendi doosgal, caggal ɗuum huutoro CTFFIND 4.1 (44) ngam anndude parametru CTF (golle mbayliigu). Fotomikrogaraamuuji tippudi caggal ɗeen ɗoon geɗe puɗɗaaɗe e golle ina kollitaa e Natal 2. S16. Template suɓngo otomatik ina heɓee e suɓaade e junngo fotde 250 piksel e 1000 partikel e nder kaɓirgal 250 piksel tawa alaa ko woni e mum so wonaa renndinde mbaydiiji ɗiɗi (2D), ɗum noon ina jaɓa ɗeen senngooji jokkondirɗi e mborosaaji sample walla ɗi ngalaa sifaaji teskaaɗi. Ndeen, suɓngo otomatik waɗaama e denndaangal mikroo-fotooji ɗii, tawi RC-LH114-W ina waɗi 849 359 partikel, kompleks RC-LH116 ina waɗi 476 547 partikel. Denndaangal partikulaaji cuɓaaɗi ɗii mbaɗii cirƴam ɗiɗi e senngo 2D ngo alaa tuugnorgal, caggal kala doggol, partikulaaji kawrooji e nokku karbon, mborosaaji sample, alaa sifaaji laaɓtuɗi walla partikulaaji gonɗi e dow mum en no feewi, njaɓaaka, ɗum noon ko 772 033 (90,9%) e 359,033 (90,9%) e 359,678 Parles are3578 (D). RC-LH114-W e RC-LH116 ko ɗi mbaydiiji keewɗi. Model 3D gadano oo feewnaa ko e kuutoragol feere jippagol ƴoƴre stokastik. Huutoraade mbaadi adanndi ndii ngam ƴeewndaade, partiiji cuɓaaɗi ɗii ndartinaama e cate nay e nder 3D. Huutoraade moodel e nder ndeeɗoo cate ngam ƴeewndaade, waɗde 3D refining e dow partikulaaji e nder cate ɓurɗe mawnude, caggal ɗuum huutoraade filtirde 15Å lowre-pass adannde ngam suddaade nokku solde, ɓeyda heen pikseluuji 6 e ŋorol softungol, e caggal-rewrude pikseluuji ɗii ngam feewnude Gatan K2 transfer function top Mo. Wonande mbaydi RC-LH114-W, ngool mbaydi adanndi waylaama e ittugol denndaangal semmbeeji to banngeeji masiŋ (jokkondirɗi e denndaangal kuuɓtodinɗe core e nder UCSF Chimera). Modeluuji keɓtinaaɗi ɗii (resolution RC-LH114-W e RC-LH116 ko 3,91 e 4,16 Å, no mbaydiiji ɗii fof) kuutortee ko ngam ƴeewndaade doggol ɗiɗmol senngo 3D. Partikulaaji kuutorteeɗi ɗii ndenndinaama e nder kalaas 3D gadano oo, ɗi ngalaa jokkondire tiiɗɗe e hoɗdiiɓe ɓee. Koolondiral walla ŋakkeende sifaaji mbaydiiji laaɓtuɗi. Caggal doggol ɗiɗaɓol senngo 3D, cate ɓurɗe toowde ɗee cuɓaama [Wonande RC-LH114-W, cate goote ko 377 703 partikel (44,5%), wonande RC-LH116, ina waɗi cate ɗiɗi, ko ina tolnoo e 260 703 partikel (44,5%) nde ɓe ngoni tan W.552 partikel caggal yirlaade adannde e seertude seeɗa]. Partikulaaji cuɓaaɗi ɗii ƴettetee kadi e nder kees 400 piksel, laaɓtinaa e peewnugol 3D. Mask solvant oo feewnirtee ko e huutoraade filtirde lowre 15Å adannde, yaajde kartal piksel 3 e mask softuɗo piksel 3. Huutoraade laɓɓingol CTF kala partikel, laɓɓingol dille kala partikel e doggol ɗiɗmol laɓɓingol CTF kala partikel, laɓɓingol 3D, masking solvant e post-processing ina mbaɗee caggal kala taƴre ngam ɓeydaade laɓɓinde mbaydi keɓtinaandi ndii. Huutoraade teddeendi taƴndi FSC (Koeffisiyen korrelaasiyoŋ koɗorɗe Fourier) 0,143, njuuteendi mbaydiiji cakkitiiɗi RC-LH114-W e RC-LH116 ko 2,65 e 2,80Å, no mbaydiiji ɗii fof. Kuraana FSC mo moodel cakkitiiɗo oo hollitaama e Natal 2. S17.
Denndaangal jokkondire poroteyiin ina ƴettee e UniProtKB : LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5) ; LH1-α (PufA; Ɓoornugol gootol: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID gooto: O83005); RC-M (PufM; ID gooto: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID gooto: A0A4Z9); Poroteyin-W (PufW; ID UniProtein: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) huutoraa ko ngam mahde mbaydi homologie RC, tawa ina waɗi jokkondire poroteyiin RC-L, RC-M e RC-H e mbaydi kiristaal Rba. RC huutoraa ko no mbaydi (ID PDB: 5LSE) (46). Huutoro kuutorgal “kartal fittaandu” e nder Kimera UCSF ngam fittaandu moodel peewnaaɗo oo e kartal (47), moƴƴinde mbaydi poroteyiin, e kofaktoor [4×BChl a (innde heddiiɓe e defterdu monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), sifaa gooto walla ɗiɗi UQ10 (U10), gooto mo wonaa heFme) gooto 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] huutoroo Coot (48) ngam ɓeydude. Nde tawnoo QAK alaa e defterdu monomer, ɗum parametruuji kuutorgal eLBOW e nder PHENIX (49).
Ko adii ɗuum, ko lowre LH1 feewnaa. E fuɗɗoode, kuutorgal mahngo otomatik e nder PHENIX (49) huutoraa ko ngam mahde otomatik feccere e doggol LH1 huutortoo kartal ngal e doggol poroteyiin LH1-α e LH1-β ngam naatde heen. Suɓo-ɗaa lowre LH1 ɓurnde timmude, yaltin-ɗaa nde, jolna-ɗaa nde e nder Coot, ɓeydu-ɗaa e junngo maa jokkondire ŋakkuɗe e nder mayre, e junngo-ɗaa laɓɓinde mbaydi ndii fof hade maa ɓeydude heen BCls ɗiɗi a (BCL) e spirilloxanthin (CRT) [fawaade e Rps jowitiiɗi heen Denndaangal mbaydi LH1 e mbaydi caroten anndaandi. Muuñal (17)]. Koppir lowre LH1 timmunde, kuutoro-ɗaa “Kuutorgal Kartal Dokkorgal” UCSF Chimera ngam dogde e nokku mo wonaa moodel mo denndaangal LH1 woni oo, caggal ɗuum laaɓtina ɗum e Coot ; fuɗɗito golle ɗee haa denndaangal ɓuuɓri LH1 ndii mooftaa. Wonande mbaydi RC-LH114-W, e ittude denndaangal ɗe ndokkaaka e nder Coot, poroteyiin oo ina seernda e geɗe heddiiɗe ɗe ngonaa poroteyiin e nder kartal Chimera USCF e kuutorgal Autobuild ngam tabitinde mbaadi adanndi, e heddiiɓe e geɗe tokoose (poroteyiin-W) Modeling. E nder FENIS (49). Ɓeydu heen kala jokkondire ŋakkuɗe e moodel keɓaaɗo e Coot (48), caggal ɗuum laaɓtin e junngo denndaangal lowre ndee. Heddii ko ɓuuɓri ndi renndaaka ina yahdi e denndaangal lipiduuji (ID defterdu monomer PDB mo CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), ɓuuɓri β-DDM (LMT) e molekule UQ10 (U10). Huutoroo PHENIX optimisation (49) e optimisation manuelle e nder Coot (48) ngam timminde moodel gadano timmuɗo haa limtooji moodel e mbaadi yiytere fittaandu nduu waawa ɓeydaade moƴƴude. E joofnirde, huutoro LocScale (50) ngam ƴellitde kartal nokkuwal, caggal ɗuum mbaɗa cirkooji goɗɗi keewɗi ngam mooftude densité mo rokkaaka e ƴellitgol otomatik e junngo.
Peptideeji ɗii, kofaktoruuji ɗii e lipiduuji e kinonuuji goɗɗi jokkondirɗi e nder denndaangal mum en ina kollitaa e nate 1 e 2. S18 haa S23. Kabaaru limto moodel cakkitiiɗo oo hollitaama e alluwal S1.
So wonaa tawa ko noon hollirtee, ƴulɓe ɓuuɓɗe UV/Vis/NIR mooftaama e ƴulɓe Cary60 (Agilent, USA) e hakkunde 1 nm tuggi 250 nm haa 1000 nm e sahaa jokkondire 0,1s.
Dillude sample oo e nder kuɓeeje kuutorteeɗe e laawol 2 mm feewde A880 e 1, mooftu heen mbaydi ɓuuɓndi hakkunde 400 e 1000 nm. Ɗeeɗoo mbaydiiji diƴƴe cirƴaaɗe mooftaa ko e mbaydi Jasco 810 (Jasco, Japon) e hakkunde 1 nm hakkunde 400 nm e 950 nm e tolno ƴeewndo 20 nm min-1.
Koolondiral majjugol moolanaangal ina anndaa e ɓuuɓnude kompleks core oo e A880 ko ina tolnoo e 50. Dillude 10μl e nder 990μl tampon jokkondirɗo walla metaan, moofta ɗoon e ɗoon mbaydi ɓuuɓndi ngam ustude ustaare BChl. Ko woni e BChl e kala sample metaan hiisaama e njuuteendi majjugol to 771 nm e 54,8 mM-1 cm-1, njuuteendi majjugol ngol anndaa (51). Feccere njuuteendi BChl fotndi e 32 (RC-LH114-W) walla 36 (RC-LH116) ngam anndude njuuteendi kuuɓtodinndi core, ndiin noon huutortee ko ngam anndude njuuteendi absorption e sample gooto mooftaa e nder koyeera Extinction buffer. feere feere. Pooze tati vurze moxxude zi mbazaama e kala sample, tawa kadi ko vursugol vursugol BChl Qy ngol huutoraa ngam hiisaade. Koolondiral majjugol RC-LH114-W fotnoongal e 878 nm ko 3280±140 mM-1 cm-1, koolondiral majjugol RC-LH116 fotngal e 880 nm ko 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 limtaama e fawaade e feere e nder (52). E raɓɓiɗinaade, HPLC faɗo mbayliigu (RP-HPLC) waɗiraa ko e kuutoragol mbaydi HPLC Agilent 1200. Ƴeewee fotde 0,02 nmol RC-LH116 walla RC-LH114-W e nder 50μl metaan:kuloroform 50:50 tawa ina waɗi 0,02% (w/v) kuloriid ferrik, ɓuuɓnee heen ɓuuɓri Beckman Coulter m4 40°C e nder ɓuuɓri HPLC (80:20 metaan:2-propanol) e dow ŋoral ×25 cm. Waɗde ɓuuɓri isokratik e nder ɓuuɓri HPLC ngam yuurnitaade ɓuuɓri to 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) e 780 nm (BChl) fotde waktu gooto. Peccol e nder 275 nm kromatogram e hojomaaji 25,5 ina hawraa, tawi alaa ko woni e mum so wonaa mbaydiiji goɗɗi ɗi njiytetee. Nokku denndinaaɗo oo huutortee ko ngam hiisaade tolno moolanaango UQ10 ƴettaango e tuugnaade e mbaydi kalibraasiyoŋ hiisaandi gila e injection standards laaɓtuɗi gila 0 haa 5,8 nmol (Natal S14). Kala seedantaagal vursaama e nder limtooji tati, tawa boowal vurngal moxxude ngal ina yahdi e SD moxxo oo.
Kosam ɗam ina waɗi RC-LH1 e ɓuuɓri Qy ɓurndi heewde 0,1, feewnaama e 30 μM sitokrom c2 ɓernde puccu ustaande (Merck, Angalteer) e 0 haa 50 μMUQ2 (Merck, Angalteer). Sammbaaji tati 1-ml peewniraa ko e kala njuuteendi UQ2, njuppaa jamma e nder niɓɓere to 4°C ngam tabitinde jokkere enɗam timmunde e nder niɓɓere hade fotde. Kuulal ngal jolnaa e nder spektorofotomeeter moolanaango OLIS RSM1000, jogiiɗo ƴulɓe 300 nm/500 laylaytol, 1,24 mm naatgol, 0,12 mm hakkunde e 0,6 mm yaltirgol. Filter pass njuuteendi 600 nm ina waɗee e damal fotosintesis sample e tuuba fotosintesis tuugnorgal ngam ittude annoore ɓuuɓnde. Absorbance oo ƴeewtaama e 550 nm e sahaa jokkondire 0,15 s. Annoore ɓuuɓnde ndee yaltata ko e LED M880F2 880 nm (Diode jalboowo annoore) (Thorlabs Ltd., Angalteer) rewrude e kaɓirgal fiɓnde e 90% tiiɗndam rewrude e jokkorgal DC2200 (Thorlabs Ltd., Angalteer) yaltata ko e ɓuuɓol annoore ngol e njuuteendi °0. Laana pooɗondiral ngal ina luurdi e gite ngam artirde kala annoore nde sample oo ƴettataa e fuɗɗoode. Yiylo absorbance 10 s hade lewru 50 s. Ndeen absorbance oo ɓeydaama ƴeewteede fotde 60 s e nder niɓɓere ngam ƴeewde no kinolol ustiri e hoore mum sitokrom c23 + (ƴeew natal S8 ngam humpitaade ko laaɓti).
Dowlaaji zi njuurnitaama e fittaandu tolno fuzzo linear e nder 0,5 haa 10 s (fawaade e tovo ngo UQ2) e vursugol tovo ngo e kala tovo ngo UQ2. Ko heewi e RC-LH1 hiisaaɗi e koye mum en e koye mum en kuutoraa ko ngam waylude tolno oo e mbaadi katalitik, ƴettaa e Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), e jokkondirde e mbaadi Michaelis-Menten ngam anndude teddeendi Km e Kcat nanndundi.
Ngam peeje ɓuuɓgol juutngol, ƴeewndo RC-LH1 ngoo ɓuuɓnaama haa ~2μM e nder tampon IMAC ina waɗi 50 mM askorbat sodium (Merck, Amerik) e 0,4 mM Terbutin (Merck, Amerik). Asid askorbik ina huutoree no dokkoowo elektoronik sadak, tert-butaclofen ina huutoree no reentorde QB ngam tabitinde wonde dokkoowo RC mawɗo oo ina heddii ina ustoo (ɗum woni, wonaa fotooksidaa) e nder golle fotde ɗee kala. Ko ina wona 3 ml eɓɓoore ndee ina ɓeydee e cellal yirlotoongal aada (fotde 0,1 m njaajeendi, 350 RPM) e njuuteendi laawol optik 2 mm ngam tabitinde wonde eɓɓoore ndee e nder laawol laser ina jogii waktuuji keewɗi ngam waawde jokkondirde e niɓɓere hakkunde pulseeji ɓuuɓɗi. Huutoro ~100-fs ngam semmbinde mbaydi laser Ti: Safir (Spectra Physics, Amerik) ngam ustude semmbe oo e 880 nm e tolno 1 kHz (20 nJ wonande NIR walla 100 nJ wonande Vis). Ko adii nde mooftata doosɗe, ƴetta sample oo e annoore ɓuuɓnde fotde hojomaaji 30. Feññinde maa addan QA ina ustoo (ina waawi ustude QA laabi ɗiɗi). Kono tesko-ɗen wonde ngool laawol ina waawi waylude sabu caggal nde dumunna juutɗo e mbaydi niɓɓiri, RC maa artu seeɗa seeɗa e golle QA. Spektromeeter Helios (Ultrafast Systems, Amerik) huutoraama ngam fooɗtude mbaydiiji gonɗi e sahaa gonaaɗo e -10 haa 7000 ps . Huutoro lowre Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Amerik) ngam ittude denndaangal dokke ɗee, caggal ɗuum kawra e njuɓɓudi. Huutoro lowre CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituwaani) ngam huutoraade doggol keɓe kawraaɗe ngam heɓde mbaydiiji ceertuɗi jowitiiɗi e ŋakkeende, walla huutoraade gollal jokkondirngal e mbaydiiji keewɗi e jaabawol kuutorgal ngam yahdude e ƴellitaare mbaydiiji njuuteendi ɓoggi gooti e nder Origin (USALa).
No mbiyru-ɗen dow nii (53), filmo fotosintetik ina waɗi kompleks LH1 mo alaa antena RC e antena LH2 periferik fof. Membraan oo ɓuuɓnaama e tris 20 mM (pH 8,0) caggal ɗuum ɓuuɓnaa e kuɓeeje kuutorteeɗe e laawol optik 2 mm. Pulse laser 30nJ huutoraa ngam ustude semmbe oo e 540 nm e sahaa leelɗo -10 haa 7000 ps. Laɓɓin doggol dokke no siforaa e Rps. pal sample.
Membraan oo pelletee ko e senngo 150 000 RCF fotde waktuuji 2 e 4°C, caggal ɗuum ɓuuɓol mum e 880 nm ɓuuɓnaa e 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM NaCl. Fuɗɗude membrane oo e ɓuuɓnude seeɗa seeɗa e nder 2% (w/v) β-DDM fotde waktu 1 e nder niɓɓere to 4°C. Sammba oo ɓuuɓnaama e 100 mM karbonaat trietilamoniyum (pH 8,0) (TEAB; Merck, Angalteer) haa 2,5 mg ml-1 (anndugol Bio-Rad). Goɗngol golle ɗee mbaɗaama gila e feere bayyinaande ko adii ndee (54), fuɗɗoraade e ɓuuɓnude 50 μg poroteyiin e nder 50 μl TEAB tawa ina waɗi 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Caggal nde sonikaaji ɗii mbaɗi fotde 60 s, ɗi ustaama e 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, UK) e nguleeki 37°C fotde hojomaaji 30. Ngam S-alkilaasiyoŋ, ɓuuɓna ƴeewndo ngoo e 10 mM metil S-metiltiyometansulfonaat (Merck, UK) ɓeydee heen e 200 mM ɓuuɓri isopropanol fotde hojomaaji 10 e nguleeki suudu. Ƴeewirde poroteyiin ndee waɗiraa ko ɓeydugol 2 μg ɓuuɓri tiripsin/endoproteinaas Lys-C (Promega UK) e ɓuuɓri 37°C fotde waktuuji 3. Kosam ɗam ƴettaa ko e ɓeydugol 50 μl asetaat etil e 10 μl 10% (v/v) asid trifluoroasetik (TFA; Thermo Fisher Scientific, Angalteer) mo tolno LC, e ɓuuɓnude ɗum fotde 60 s. Seerndude fasaade ndee ina yahdi e senngo 15 700 RCF fotde hojomaaji 5. E fawaade e porotokol peewnoowo oo, ko koloñaal spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Angalteer) huutoraa ngam aspirde e ɓuuɓnude no feewi faɗo les ngo peptiid oo woni e mum oo. Caggal nde yoori e senndifugo vacuum, seedantaagal ngal ɓuuɓnaama e 0,5% TFA e 3% asetonitril, 500 ng ƴeewtaama e nanoflow RP kromatogaraafi wondude e spektorometri masse kuutortooɗo parametruuji sisteem ɗi cifaaɗi ko adii.
Huutoro MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ngam anndude e limtude poroteyiin ngam yiylaade Rps. ɓuuɓri ƴiiƴam (www.uniprot.org/proteoms/UP000001426). Doggi poroteyiinuuji spektorometri mass ɗii ndarnaama e nder fedde ProteomeXchange rewrude e lowre gollodiiɓe PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) e les njiimaandi doggi PXD020402.
Ngam ƴeewndaade e RPLC wondude e spektorometri masse iyonisaasiyoŋ elektoro-spray, kompleks RC-LH1 feewnaama e Rps ladde. E kuutoragol feere bayyinaande ko adii ndee (16), njuuteendi poroteyiin peewniraaɗo e nder geese palustris ko 2 mg ml-1 e nder Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM e 0,03% (w/v) β- (anndugol Bio-Rad) ) DDM. E fawaade e porotokol peewnoowo oo, huutoroo kaɓirgal laaɓtungal 2D (GE Healthcare, USA) ngam ittude 10 μg poroteyiin e feere ɓuuɓnde, ɓuuɓna ɓuuɓol ngol e nder 20 μl 60% (v / v) asid formik (FA), 20% (v / v) Asetonitril/ 20% ndiyam (2)vv. Mikroliiteeruuji joy ƴeewtaama e RPLC (Dionex RSLC) wondude e ƴeewndo masse (Maxis UHR-TOF, Bruker). Huutoroo koloñaal MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Angalteer) ngam seerndude e 60°C e 100μlmin -1, tawa ina waɗi 85% (v / v) ɓuuɓol A [0,1% (v / v) FA e 0,02% (V/v) ɓuuɓol B8/que a5 [0,1%(v/v) FA e 0,02%(v/v) e nder 90%(v/v) asetonitril TFA] Huutoraade ƴulɓe iyonizaasiyoŋ elektoro-spray e parametruuji defaare ko ɓuri hojomaaji 60, ƴulɓe masse keɓata ko 100 haa 2750 m/z (njuuteendi masse-to-charge). E ballal kuutorgal FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) portal resooji bioinformatik ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), kartal mbaydi maslahaa haa e nder njuuteendi kompleks oo.
Ɓowɗi ɗii mawnaama fotde waktuuji 72 e les 100 ml annoore NF-lowre (10 μMm-2 s-1), hakkundeere (30 μMm-2 s-1) walla toownde (300 μMm-2 s-1). Hakkunde M22 (hakkunde M22 nde sulfaat amoniyum woppitaa, suksinaat sodium lomtinaa asetaat sodium) e nder ɓuuɓri 100 ml (23). E nder cirkooji joy 30-s, ɓuuɓri gilaas 0,1 mikron ɓuuɓnaama e njuuteendi 1:1 ngam limtude ƴiye ɗee, ɓuuɓnaa e dow ice fotde hojomaaji 5. Huunde nde ɓuuɓnataa, cellal ngal ɓuuɓnaaka e ɓuuɓri gilaasi, ittaa ko e senngo 16 000 RCF fotde hojomaaji 10 e nder mikroo-senndifuge benchtop. Membraan oo seerndaa ko e rotor Ti 70,1 e 100 000 RCF e nder 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e 40/15% (w/w) njuuteendi sukrose fotde waktuuji 10.
No siforaa e golle men ɓennuɗe ɗee nii, immunodetektik tag His e dow PufW (16). E raɓɓiɗinaade, kompleks core laaɓtuɗo (11,8 nM) walla membrane jogiiɗo RC gooto (ko anndiraa e oksidaasiyoŋ ittugol spekter ceertuɗo ustaare e nanndinde teddeendi e dow gel ɓuuɓɗo) e nder 2x SDS loading buffer (Merck, UK) dilluɗo laabi ɗiɗi. Poroteyin oo seerndaa ko e mbaydi 12% bis-tris NuPage (Thermo Fisher Scientific, Angalteer). Gel ina ɓuuɓnaa e ɓuuɓri Coomassie (Bio-Rad, Angalteer) ngam loowde e yiytude ɓuuɓri RC-L. Poroteyin gonɗo e gel ɗiɗaɓo oo, waɗtaa e mbaydi mbaylaandi (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Angalteer) ngam ƴeewndaade ñawu nguu. Membraan PVDF oo udditaama e nder 50 mM tris-HCl (pH 7,6), NaCl 150 mM, 0,2% (v / v) Tween-20 e 5% (w / v) ɓuuɓri ƴiiƴam, caggal ɗuum ɓuuɓnaa e ɓuuɓri ƴiiƴam gonndi e His (e nder tampon tris-H0p [Dilute mH-5l 7,6), NaCl 150 mM e 0,05% (v/v) hakkunde-20] e nder 1:1000 A190-114A, laboratuwaaruuji Betil, Amerik) fotde waktuuji 4. Caggal nde loowaa laabi 3 e nder hojomaaji 5 e nder tampon antibiotik, membrane oo hawraama e tampon antibiotik peroksidaas (Sigma-Aldrich, UK) (diluted 1:10,000 e nder tampon antibiotik) W ina ɓuuɓna ngam newnude yiytude (hojomaaji 5 caggal loowdi 3 e nder tampon antibiotik cheluscence EESTAR0) (Siyanagen, Itali) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Angalteer).
E ƴettude peccitagol tiiɗndam kala laawol gel walla immunoassay, naatde e nokku gonɗo les ɓuuɓol ngol e hiisaade njuuteendi tiiɗndam RC-L (gel ɓuuɓɗo) e Protein-W (immunoassay), e nder ImageJ (57) Laɓɓin natal ngal. Ɗeeɗoo limtooji mbaɗtaa ko limtooji moolanaaɗi e teskaade wonde limtooji RC-L e poroteyiin-W e nder sample RC-LH114-W laaɓɗo oo ko 1:1 e normaliseede denndaangal doosɗe ɗee no haanirta nii.
Ngam heɓde geɗe ɓeydooje e ndee winndannde, ƴeew http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ko winndannde udditiinde renndinde e nder sarɗiiji Liiseeji Creative Commons. Winndannde ndee ina addana huutoraade, renndinde, e ƴellitde e kala fannu tawa ko e sarɗiiji ɗi golle asliije ɗee cifaa no haanirta nii.
Tesko: Min ñaagii ma tan ko yo a rokku adrees imeel maa mbele neɗɗo mo njiɗ-ɗaa wasiyaade hello ngoo ina annda aɗa yiɗi ɓe njiya imeel oo, tawa wonaa spam. Min nanngataa hay adrees imeel gooto.
Ngal naamnal huutortee ko ngam ƴeewde so tawii ko a njillu e haɗde neldude spam otomatik.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elisabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F
Sifaa toowɗo gonɗo e mbaydi 1 light trap complex e nder nokku gonɗo e mbaydi mbaylaandi ina rokka humpitooji kesi e nder dinamiik kinon.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elisabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F
Sifaa toowɗo gonɗo e mbaydi 1 light trap complex e nder nokku gonɗo e mbaydi mbaylaandi ina rokka humpitooji kesi e nder dinamiik kinon.
©2021 Fedde Ameriknaare ngam ɓamtaare ganndal. hakkeeji fof ina njogii. AAAS ko gollodiiɗo e HINARI, AGORA, OARE, KOOR, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. Ganndal ina yahra yeeso ISSN 2375-2548.